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器官移植被称为“现代医学之巅”,是临床治疗终末期器官疾病的有效手段,2018年我国实施器官移植手术2.02万例,较2017年增加21%,跃居世界第二。然而,移植排斥反应仍然是导致移植器官功能丧失的重要原因,因此相当一部分患者不得不再次接受器官移植,而再次移植后的急性排斥反应会发生得更早更强烈,且目前尚未找到抗再次器官移植排斥反应的有效药物。临床实践中发现,对于首次器官移植失败后需再次移植的病人,由于机体免疫系统已对首次移植器官后产生的某些特定抗原拥有了免疫记忆。当再次将器官移植进入机体后,机体即可在短时间内对移植器官产生急性排斥反应,发生的程度比首次排斥反应更加强烈,并且对现阶段临床上使用的抗排斥反应药物不敏感。因此,如何能有效控制由免疫记忆引起的再次移植急性排斥反应,是当前亟待解决的科学问题。本实验室前期研究发现,效应记忆性CD8+T细胞(Effector memory CD8+T cells,CD8+TEM)会导致受体对供体（移植器官）的急性排斥反应发生更快、更强烈,且对抗移植排斥反应药物环孢素A不敏感。因此,如何抑制CD8+TEM所致再次移植急性排斥反应是必须攻克的难题。据此,我们首先利用单细胞测序技术寻找能够有效抑制CD8+TEM所致再次移植急性排斥反应的关键分子。然后,验证阻断该关键分子是否可对CD8+TEM增殖与活性发挥理想的抑制作用并探讨其作用机制,完成体外相关实验及研究。最后,通过构建同种异体小鼠再次器官（心脏）移植模型,体内验证该关键分子是否可有效抑制CD8+TEM所介导的再次器官移植急性排斥反应。本课题主要研究内容及结果如下:目的:通过探寻效应记忆性CD8+T细胞的关键分子,实现对效应记忆性CD8+T细胞引起的再次器官移植急性排斥反应的有效抑制。方法:1.运用Smart-seq2方案构建单细胞转录组测序文库,通过高通量测序技术对c DNA文库进行测序,对测序结果进行生物信息学分析从而寻找CD8+TEM所致再次移植急性排斥反应的关键分子及可能的作用机制。2.采用q PCR、WB、ELISA等方法对单细胞测序结果进行验证;CFSE染色法、ELISA验证运用该关键分子的拮抗剂单克隆抗体阻断该关键分子对CD8+TEM增殖与活性的影响;利用整合素α1（Integrinα1,itga1）单克隆抗体和PI3K小分子阻断剂分别阻断CD8+TEM的itga1和PI3K位点,用WB在不同时间点（0 min,2 min,5 min,10 min,15min,30 min）分别检测PI3K-Akt信号通路上的下游蛋白p-PI3K/PI3K,p-Akt/Akt,p-p21/p21,p-p27/p27和CDK6的表达情况,验证itga1发挥作用的机制,完成体外相关实验及研究。3.构建同种异体小鼠再次器官（心脏）移植模型,移植前1天将细胞浓度为5×10~5/m L的CD8+TEM细胞悬液1 m L通过尾静脉注射的方法过继到受体鼠体内,然后再进行同种异体小鼠心脏移植。移植成功后,手术当天即将关键分子itga1的拮抗剂itga1单克隆抗体导入体内。通过观察移植心脏的存活时间、移植心脏急性排斥反应的病理组织学分级、受体小鼠血清中趋化因子配体3（Chemokine C-C motif ligand 3,CCL3）、趋化因子配体4（Chemokine C-C motif ligand 4,CCL4）、干扰素-γ（Interferon-γ,IFN-γ）的浓度、CD8+TEM在受体小鼠体内移植心脏和脾脏中的分布等指标,体内验证该关键分子拮抗剂能否有效抑制CD8+TEM所致再次移植急性排斥反应并探讨其可能的分子免疫学机制。结果:1.单细胞测序结果显示:itga1、CCL3、CCL4、IFN-γ在CD8+TEM上呈高表达,itga1通过PI3K-Akt信号通路发挥其对CD8+TEM增殖活性的调控作用。2.q PCR结果显示:itga1在CD8+TEM的表达量显著高于CD8+TNA细胞(Na?ve CD8+T cells,CD8+TNA)（P＜0.0001）和中央记忆性CD8+T细胞(Central memory CD8+T cells,CD8+TCM)（P＜0.0001）;CCL3在CD8+TEM的表达量显著高于CD8+TNA（P＜0.0001）和CD8+TCM（P＜0.01）;CCL4在CD8+TEM的表达量显著高于CD8+TNA（P＜0.001）和CD8+TCM（P＜0.05）;IFN-γ在CD8+TEM的表达量显著高于CD8+TNA（P＜0.0001）和CD8+TCM（P＜0.0001）。3.WB结果显示:itga1在CD8+TEM的表达量显著高于CD8+TNA（P＜0.0001）和CD8+TCM（P＜0.05）。4.ELISA结果显示:CCL3在CD8+TEM的表达量显著高于CD8+TNA（P＜0.0001）和CD8+TCM（P＜0.0001）;CCL4在CD8+TEM的表达量显著高于CD8+TNA（P＜0.0001）和CD8+TCM（P＜0.0001）;IFN-γ在CD8+TEM的表达量显著高于CD8+TNA（P＜0.0001）和CD8+TCM（P＜0.0001）。5.使用itga1关键分子的拮抗剂itga1单克隆抗体对CD8+TEM的itga1位点进行封闭,CFSE染色法结果显示:CD8+TEM的增殖指数呈显著下降（P＜0.05）;ELISA结果显示:CD8+TEM分泌CCL3、CCL4、IFN-γ的量也呈显著下降（P＜0.0001）。itga1单克隆抗体对CD8+TEM的增殖与活性起到显著的抑制作用。6.使用itga1单克隆抗体阻断CD8+TEM的itga1位点,WB结果显示:PI3K-Akt信号通路上itga1关键位点的下游蛋白p-PI3K/PI3K,p-Akt/Akt,p-p21/p21,p-p27/p27,CDK6的表达呈显著下降（P＜0.05）;利用PI3K小分子阻断剂阻断CD8+TEM的PI3K位点,WB结果显示:PI3K-Akt信号通路上PI3K关键位点的下游蛋白p-Akt/Akt,p-p21/p21,p-p27/p27和CDK6的表达呈显著下降（P＜0.05）。该结果验证了itga1是通过PI3K-Akt信号通路发挥对CD8+TEM增殖活性的调控作用。7.同种异体小鼠再次器官（心脏）移植模型的体内实验结果显示:使用关键分子itga1拮抗剂itga1单克隆抗体对CD8+TEM所致的同种异体小鼠再次器官（心脏）移植模型的急性排斥反应进行治疗,移植心脏的存活时间由4.5±1.0天提高到8.8±1.8天,差异具有统计学意义（P＜0.001）。移植心脏急性排斥反应程度的病理组织学分级评分由2.670±0.516分降低至0.833±0.753分,差异具有统计学意义（P＜0.001）。使用itga1单克隆抗体干预的受体小鼠血清中CCL3、CCL4、IFN-γ的含量显著低于未使用itga1单克隆抗体干预的受体小鼠血清中的含量（P＜0.001）。移植后3天,使用itga1单克隆抗体干预的受体小鼠移植心脏中CD8+TEM的比例显著低于未使用itga1单克隆抗体干预的受体小鼠移植心脏中CD8+TEM的比例（P＜0.001）;使用itga1单克隆抗体干预的受体小鼠脾脏中CD8+TEM的比例显著低于未使用itga1单克隆抗体干预的受体小鼠脾脏中CD8+TEM的比例（P＜0.0001）。以上结果体内验证了itga1关键分子的拮抗剂itga1单克隆抗体可有效抑制CD8+TEM所致的同种异体小鼠再次器官（心脏）移植急性排斥反应。结论:1.成功将单细胞测序技术应用到器官移植排斥反应领域的研究。2.itga1在CD8+TEM上高表达,通过PI3K-Akt信号通路发挥对其增殖活性的调控作用。itga1是影响CD8+TEM增殖与活性的关键分子。3.应用itga1关键分子拮抗剂itga1单克隆抗体,可明显抑制CD8+TEM细胞的增殖与活性,并有效减轻CD8+TEM所致同种异体小鼠再次器官（心脏）移植急性排斥反应,明显延长移植心脏的存活时间。4.本研究结论为临床研发能有效抑制由免疫记忆所致的再次移植急性排斥反应的治疗新方法提供新思路。