论文部分内容阅读
对于重度、极重度感音神经性耳聋(Sensorineural Hearing Loss,SNHL)患者来说,电子耳蜗(Cochlear Implant,CI)是目前唯一有效的治疗手段,迄今为止已帮助约50万听障患者重获新声。但在复杂的声音环境中,他们的言语识别能力仍远低于常人,这是由于CI本身编码能力有限所致。正常人能区分2000种不同频率的声音,而目前的CI只有12-24个频率通道,因此这些患者在音乐鉴赏方面,特别是听辨高音和音色时仍不理想。光遗传学技术的问世为这一困境带来了希望,光敏感蛋白兼具高时间敏感性和高空间特异性,可精准调控耳蜗螺旋神经节细胞(Spiral Ganglion Neurons,SGNs),提高听觉敏感度及强度,帮助听障患者获得更好的听觉体验。2014年德国学者Moser将光敏感蛋白表达在小鼠耳蜗SGNs上,并利用蓝光成功诱发了听觉电位。Wrobel等在2018年通过光遗传学刺激重建了部分耳聋沙鼠的听觉行为。这些重要发现显示光遗传学技术不论在CI的优化改良还是耳聋治疗领域均大有可为。目前用于光遗传学耳蜗刺激研究的主要动物模型为啮齿类,我们认为这些重要的研究成果如能在听觉系统更接近于人的大动物模型上得到验证,对于光学耳蜗(Optical Cochlear Implant,oCI)的临床转化研究及SNHL的临床治疗意义会更加重大。本研究中我们利用腺相关病毒介导的光敏感蛋白?视紫红质通道蛋白2(Channelrhodopsin-2 ChR2)基因转染白化耳聋荣昌猪耳蜗SGNs,建立遗传学大型耳聋动物模型,探索光敏感蛋白对耳聋大动物SGNs的调控机制,为光耳蜗的研发及SNHL的临床治疗提供直接的实验和理论支持。第一部分豚鼠光遗传学技术验证目的:构建光遗传学成年哺乳动物模型,验证病毒及导入方式的安全性,探索成年哺乳动物光遗传学刺激参数。方法:选取350-400g的成年豚鼠20只,随机均分为两组,一组经圆窗导入AAV2/8-hSyn-ChR2(H134R)-mCherry构建光遗传学成年哺乳动物模型,一组经圆窗导入生理盐水作为对照组。记录分析导入前后短声(Click)诱发的听性脑干反应(Auditory Brainstem Response ABR)阈值,潜伏期及振幅,共聚焦显微镜观察病毒导入3周后光敏感蛋白在耳蜗SGNs的表达情况,470nm蓝光刺激转染SGNs并记录光诱发复合动作电位(Optically Evoked Compound Action Potential,oCAP)探索光遗传学刺激实验参数。结果:导入后豚鼠ABR阈值较导入前增加约6dB,手术及病毒导入对豚鼠听力影响较小。免疫荧光染色发现转染3周后豚鼠SGNs可见光敏感蛋白表达,利用470nm蓝色激光刺激SGNs成功诱发出oCAP。oCAP在激光强度高于3.7mW时可被诱发,其幅值随着激光强度增加而增大。5.8mW的激光能量所诱发的oCAP幅值最大,为0.78μv,这与40dB SPL声刺激诱发的复合动作电位(Acoustically Evoked Compound Action Potential,aCAP)接近,40dB SPL的aCAP幅值为0.7μv。结论:成功利用成年豚鼠建立光遗传学哺乳动物模型,动物耳蜗转染前后听力损失较小,证明经圆窗导入的转染方式安全。免疫组化染色验证了光敏感蛋白在成年豚鼠SGNs的表达、电生理实验成功记录到oCAP,表明光遗传学刺激参数可靠,为探索光遗传学转染大型哺乳动物SGNs奠定了基础。第二部分荣昌猪听功能及内耳形态学研究目的:研究荣昌猪听功能及内耳形态学特征,选择年龄合适的荣昌猪用于光遗传学大动物模型构建。方法:记录分析出生后不同阶段(P1,P7,P14和P28)的正常荣昌猪与白化荣昌猪Click-ABR阈值、潜伏期及振幅,测听结束后进行耳蜗取材,分别制作耳蜗基底膜铺片及冰冻切片,结合免疫荧光染色观察耳蜗毛细胞、血管纹及SGNs等结构。结果:白化荣昌猪P1时即为双耳重度感音神经性聋,正常荣昌猪ABR阈值为35-40dB SPL,ABR波形与人类的相似,均有七个波,各波潜伏期和振幅随着年龄增长而变化,在P14趋于稳定;白化荣昌猪P1时毛细胞及纤毛与正常荣昌猪无明显差异,P7时开始出现外毛细胞确缺失,部分纤毛聚集成簇、倒伏甚至缺失,内毛细胞在P28时仍存在;P14时SGNs仍与正常荣昌猪的无明显差异,P28时较P1减少23.72%,较同龄正常荣昌猪的SGNs减少24.94%;血管纹P1时即变薄。结论:通过研究分析正常荣昌猪及白化荣昌猪的听功能及内耳形态学特征,首次发现P14-P28是白化耳聋荣昌猪病理进展的一个重要节点,建议相关治疗研究在该时间窗内或此前进行。第三部分白化耳聋荣昌猪光遗传学研究目的:建立光遗传学耳聋大动物模型,明确耳聋大动物光遗传学刺激实验参数,探索光敏感蛋白对耳聋大动物SGNs的调控机制,为光耳蜗的研发及SNHL的治疗提供直接的实验和理论支持,为解释Waardenburg综合征的病理机制及治疗提供新思路。方法:选取P14正常荣昌猪6只,随机均分为两组,一组用于构建光遗传学大动物模型,一组为生理盐水对照组。测定导入前后Click-ABR,分析阈值、潜伏期及振幅变化。免疫荧光染色验证光敏感蛋白在荣昌猪SGNs的表达情况。选取白化耳聋荣昌猪11只,8只经圆窗导入AAV2/8-hSyn-ChR2(H134R)-mCherry转染SGNs构建光遗传学大型耳聋动物模型,3只为生理盐水导入对照组。470nm蓝光刺激转染耳蜗SGNs诱发oCAP探索光遗传学刺激实验参数,免疫荧光染色验证光敏感蛋白在转染耳聋猪耳蜗SGNs的表达。结果:成功经圆窗膜将AAV2/8-hSyn-ChR2(H134R)-mCherry导入荣昌猪耳蜗,正常荣昌猪导入后ABR阈值较导入前增加约8dB,手术及病毒导入对正常荣昌猪听力影响较小。免疫荧光共定位发现正常及白化耳聋荣昌猪SGNs均成功表达了光敏感蛋白,470nm的蓝色激光刺激转染白化耳聋荣昌猪的耳蜗SGNs,未记录到oCAP。结论:国内外首次利用光遗传学成功转染耳聋大动物耳蜗SGNs,将进一步在耳聋动物模型上尝试记录oCAP,同时探索光刺激信号编码的时间、频率和强度分辨率,为未来光耳蜗的研发提供更有力的实验依据。白化荣昌猪是人类Waardenburg综合征2A型疾病的天然动物模型,我们的研究也将有利于解释Waardenburg综合征的病理机制并为其治疗提供新思路。