桦褐孔菌是民间传统的药食两用真菌,其富含多种化学成分且具有显著的抗炎、抗肿瘤、抗突变、降脂降压以及抗病毒等多种生物活性。桦褐孔菌醇是桦褐孔菌中特有的一种羊毛脂烷型三萜类活性化合物,其生物活性及其丰富。桦褐孔菌醇能广泛抑制肿瘤细胞的增殖,且在不同肿瘤细胞中的作用机制不尽相同。本论文首次研究了桦褐孔菌醇对人宫颈癌细胞系HeLa细胞的增殖性的抑制作用,且分析了不同浓度的桦褐孔菌醇对HeLa细胞迁移能力、侵袭能力和促凋亡的影响及初步分子机制,进一步明确了 p53信号途径是桦褐孔菌醇抗宫颈癌HeLa细胞的关键分子机制。本文主要研究成果如下:1.桦褐孔菌醇可显著抑制HeLa细胞的生长和增殖。MTT结果表明,桦褐孔菌醇剂量依赖性的抑制HeLa细胞的生存活力,并且在48 h和72 h的处理下IC50值分别为58.9和39.8 μM。同时,选取了 5-FU作为阳性对照,结果显示桦褐孔菌醇的抗癌作用与5-FU具有一致性,并在有效的治疗范围内以浓度为50 μM作为后续的实验条件。为了进一步评价其有效性,探究了桦褐孔菌醇对HeLa细胞形态和增殖的影响。结果显示,25 μM浓度以下的桦褐孔菌醇对HeLa细胞的形态无显著的影响;且当桦褐孔菌醇的浓度高于25μM时,可诱导HeLa细胞的形态发生皱缩,变圆以及凋亡,其作用效果具有一定的剂量依赖性。此外,相似的结晶紫染色结果进一步表明了桦褐孔菌醇有效抑制了 HeLa细胞的增殖,且当浓度高于25μM时抑制作用显著。2.桦褐孔菌醇有效抑制HeLa细胞迁移、侵袭和诱导细胞凋亡。伤口愈合实验和Trans-well实验证实了桦褐孔菌醇(5、10、25 μM)可以有效的抑制HeLa细胞的迁移性和侵袭性,并从分子水平上降低HeLa细胞中MMP2和MMP9蛋白的表达。同时,流式细胞结果显示:桦褐孔菌醇(30、40、50 μM)可以诱导HeLa细胞发生凋亡,激活凋亡蛋白水解酶Caspase-3的活性,进而上调促凋亡相关蛋白Cleaved PARP、Cleaved Caspase-3和Bax的表达,下调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达。此外,在桦褐孔菌醇作用HeLa的过程中,均会激活肿瘤抑制因子p53的转录,进而导致p53和p21蛋白水平的增加。因此,初步推测肿瘤抑制因子p53与桦褐孔菌醇抑制宫颈癌HeLa细胞的迁移、侵袭和诱导细胞凋亡的过程密切相关。3.桦褐孔菌醇通过介导p53信号途径,调控HeLa细胞的迁移、侵袭和诱导细胞凋亡。分别利用阴性对照组(si-NC)和特异的p53基因的小干扰RNA(si-p53)预处理HeLa细胞后,结果发现,相对于si-NC组,si-p53抑制了 HeLa细胞中p53基因的转录活性,降低了 mRNA的含量,同时,Western blotting分析结果显示,蛋白p53和p21的表达也显著降低,以上结果均说明实验成功沉默了 p53基因。此外,实验结果表明,相比于空白对照组,si-NC组中的桦褐孔菌醇可有效的抑制HeLa细胞的迁移和侵袭,并通过下调MMP2和MMP9蛋白的表达水平佐证了其抑制的有效性;然而当沉默p53基因时,si-p53组中的桦褐孔菌醇不能有效的抑制HeLa细胞的迁移和侵袭,其抑制MMP2和MMP9蛋白表达的作用也被逆转。同时,研究结果也表明了在si-NC组中桦褐孔菌醇通过激活凋亡水解酶Caspase-3的活性,调节了促凋亡蛋白与抗凋亡蛋白的表达进一步引发HeLa细胞凋亡;反之,在si-p53组中,当沉默p53基因时,桦褐孔菌醇诱导细胞凋亡的作用也被逆转。以上结果表明,肿瘤抑制因子p53是桦褐孔菌醇抑制HeLa细胞增殖、迁移、侵袭和诱导细胞凋亡的过程中调控的关键靶蛋白。综上所述,桦褐孔菌醇具有抑制HeLa细胞增殖、迁移、侵袭和诱导细胞凋亡的作用,揭示了 p53基因在预防恶性肿瘤转移和侵袭方面的潜力,为桦褐孔菌醇治疗宫颈癌等肿瘤疾病提供了科学依据。