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抗生素的长期广泛使用导致病原菌的抗药性问题及其在畜牧产品中残留问题己严重威胁着人类的健康。因此,开发一种高效、安全的抗生素替代品成为饲料添加剂研究的重要方向,而具有多种生物学功能的抗菌肽显示出广阔的应用潜力。Is CT是来源于马达加斯加黑爪蝎(Opisthacanthus madagascariensis)毒液里的一种有细胞毒性的(cytotoxic)线性肽,由不含半胱氨酸的13个氨基酸残基组成,它的分子量1502.9Da,没有细胞选择性。研究表明Is CT衍生物[L6,K11]-Is CT具有比Is CT更好的抑菌效果,且对哺乳动物红细胞有很低的溶血活性;Clavanin来源于柄海鞘(Styela claca)血细胞,由23个氨基酸残基组成,具有α-螺旋结构,在分子大小、结构和抗菌活性上类似于从欧洲蟾蜍(Xenopus laevis)中分离的Magainins;Pa-AMP05分离于美洲商陆(Phytolacca americanan L.)种子,由38个氨基酸残基组成,含有6个半胱氨酸,形成三对二硫键,分子量为4193.8Da,等电点为9.3,呈碱性。本课题旨在利用基因工程技术实现抗菌肽Is CT、Clavanin和Pa-AMP05分别在毕赤酵母和酿酒酵母中的高效表达,为抗菌肽Is CT衍生物、Clavanin和Pa-AMP05生产工艺的研发及其它抗菌肽的研究开发奠定理论与实践基础。主要研究内容如下:1)采用重叠延伸PCR方法,根据毕赤酵母的密码子偏好性,按照Is CT衍生物、Clavanin和Pa-AMP05的氨基酸序列设计合成其编码基因。2)分别构建Is CT衍生物、Clavanin和Pa-AMP05在毕赤酵母中的表达载体,电转化毕赤酵母后,摇瓶诱导发酵,对发酵液上清进行初步活性检测,结果表明三株重组毕赤酵母的发酵液上清对S.aureus ATCC 25923和E.coli ATCC 8739均有抑菌活性,且菌株X33/p PICZαA-Is CT诱导72h时抑菌圈直径最大,目的蛋白表达产量达到最高;菌株X33/p PICZαA-Clavanin诱导72h时抑菌圈直径最大,目的蛋白表达产量达到最高;菌株X33/p PICZαA-AMP05经诱导96h时抑菌圈直径最大,目的蛋白表达产量达到最高。3)分别构建Is CT衍生物、Clavanin和Pa-AMP05在酿酒酵母中的表达载体,转化酿酒酵母后,摇瓶诱导发酵,对发酵液上清进行初步活性检测,结果表明三株重组酿酒酵母的发酵液上清对S.aureus ATCC 25923和E.coli ATCC 8739均有抑菌活性,且菌株INVSc1/p YES2α-Is CT诱导72h时抑菌圈直径最大,目的蛋白表达产量达到最高;菌株INVSc1/p YES2α-Clavanin诱导72h时抑菌圈直径最大,目的蛋白表达产量达到最高;菌株INVSc1/p YES2α-AMP05诱导96h时抑菌圈直径最大,目的蛋白表达产量达到最高。