维氏气单胞菌中与tmRNA启动子互作的转录因子CysB功能研究

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维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)是一种人-鱼共患病原菌,可引起多种经济鱼类细菌败血症等疾病,致使水产养殖业损失严重。维氏气单胞菌含有转移-信使RNA(tm RNA)和小蛋白B(Smp B)介导的反式翻译系统,此系统可以通过拯救滞留核糖体,使细菌抵抗外界环境的压力。在信号传递通路中,以前的研究仅限于tm RNA调节的下游,未见调控tm RNA的上游信号的挖掘和报道。本研究以维氏气单胞菌tm RNA为研究对象和切入点,致力于研究调控tm RNA的上游转录因子。研究结果如下:第一,以tm RNA启动子(Pssr A)序列为靶标,通过卷积神经网络预测到Lys R家族转录因子Cys B可能调控tm RNA。第二,验证了Pssr A与Cys B之间的相互作用。细菌单杂交实验中,共表达Cys B和Pssr A的转化子能够在添加10 m M 3-AT和链霉素的抗性筛选板上生长,说明Cys B与Pssr A相互作用;凝胶阻滞实验(EMSA)中,加有30 ng Cys B蛋白后,Pssr A会出现滞后现象,当加有过量特异性竞争DNA后,滞后带消失,说明Cys B特异性结合Pssr A。第三,探究了Cys B对tm RNA的调控。荧光强度测定实验中,Pssr A与Cys B共表达时,菌株荧光值极显著提高,说明Cys B正调控tm RNA使e GFP表达量增加。实时荧定量PCR(RT-q PCR)实验中,cys B敲除后,tm RNA相对表达量显著降低。以上结果表明Cys B正调控tm RNA。第四,探索Cys B结合Pssr A的关键位点。通过原核生物调控数据库PRODORIC2查找到Cys B结合DNA序列的通式5’-NDDDNGWTATNNNNNNNNNHWWNBNMN NHWK-3’,与Pssr A序列比对,截短Pssr A保留Cys B结合Pssr A的区域,通过EMSA实验证明Pssr A截短后仍与Cys B结合。为了找出Cys B与Pssr A相互作用的关键位点,将Pssr A的序列上TAT、ATTTTT与ACAAT位点(分别为位点1、位点2和位点3)进行突变,通过细菌单杂交和荧光强度测定实验表明位点2和位点3是Cys B结合Pssr A的关键位点。第五,查究Cys B调控tm RNA对维氏气单胞菌运动和生物被膜的影响。分析转录组数据发现,鞭毛合成相关基因下调,包括fli C、flg L、flg K、fli K、flg D、flg E、flg F、flg G、flg H等基因。泳动实验表明,ssr A或cys B敲除后,运动能力降低。这与转录组数据相符。生物被膜实验表明,ssr A或cys B敲除后,生物被膜形成能力亦降低,这与泳动实验结果一致。以上结果表明Cys B调控tm RNA影响细菌泳动能力和生物被膜形成能力。本文首次在维氏气单胞菌中研究调控tm RNA的上游转录因子,补充了以tm RNA为核心的调控系统。Cys B正调控tm RNA,增强了维氏气单胞菌泳动和生物被膜形成能力,而细菌的运动和生物被膜都与毒力相关,这为探索维氏气单胞菌引起致病机制提供新线索。
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