论文部分内容阅读
乳腺作为一种与哺乳动物繁殖周期密切相关的重要第二性征器官,其发育和泌乳受多重因素的调控,其中乳腺特异性转录因子STAT5a在调控乳腺发育及泌乳过程中有重要作用。有研究表明,催化组蛋白3第9位赖氨酸三甲基化(H3K9me3)的特异性组蛋白甲基化转移酶SUV39H1/2与染色质浓缩和基因表达调控等密切相关。为了解SUV39H1/2基因在乳腺发育和泌乳过程中的作用,本研究拟采用RNA干扰技术探讨SUV39H1/2基因表达下调对水牛乳腺上皮细胞增殖、乳腺发育及STAT5a等泌乳相关基因表达的影响,以阐明H3K9me3在调控水牛乳腺发育及泌乳方面的作用。研究取得如下结果。1.5UV39H1/2对水牛乳腺上皮细胞增殖以及泌乳相关基因表达的影响首先利用293T细胞包装获得SUV39H1/2-shRNA慢病毒,通过慢病毒感染水牛乳腺上皮细胞,观察其对细胞增殖的影响。结果发现,与未感染组相比,SUV39H1/2基因表达下调可以促进乳腺上皮细胞的增殖;流式细胞仪检测细胞周期时发现,实验组细胞周期阻滞在S期,G0/G1期细胞比例无显著差异,G2期比例显著减少(P<0.05)。qRT-PCR结果显示,5UV39H1/2基因表达下调显著降低与乳腺上皮细胞分化及乳蛋白合成相关相关基因STAT5a、mTOR、ELF5、CSN1S1、以及乳脂合成相关基因srebp1、fabp3的表达(P<0.05)。2.SUV39H1/2基因表达下调对水牛乳腺上皮细胞STAT5a基因启动子甲基化水平影响首先克隆不同长度水牛STAT5a启动子区,获得2190 bp、355 bp、417 bp片段。双萤光素酶报告基因系统检测结果发现,三个片段均具有启动子活性,2190 bp片段活性显著高于其他两条(P<0.05)。通过转录因子结合位点分析发现,2190 bp启动子区存在多个转录结合位点,包括 sp1、p300、p53、NF-kB 等。其次利用SUV39H1/2-shRNA慢病毒感染乳腺上皮细胞,72 h后收集细胞提取DNA,通过亚硫酸氢盐修饰方法处理全基因组DNA,并测序。结果发现,未处理组STAT5a启动子区甲基化水平为15.5%,下调SUV39H1/2基因表达的处理组细胞中,STAT5a启动子区甲基化程度为31.5%。以上结果说明,下调SUV39H1/2基因的表达能够促进水牛乳腺上皮细胞的增殖;SUV39H1/2基因可能通过调控STAT5a启动子甲基化水平,进而调控乳腺上皮细胞生长分化、乳汁和乳蛋白合成相关基因表达。