论文部分内容阅读
历史上,全球范围内的流感病毒广泛流行,造成上千万人的死亡和巨大的经济损失,严重威胁人类的公共安全和社会经济。自1997年首例H5N1亚型高致病性禽流感病毒突破种间屏障感染人并致死事件以来,该病毒一直在整个东南亚地区肆虐,预示有可能出现流感大流行病毒株。疫苗免疫接种是流感防治的最有效的手段。在全病毒灭活疫苗株的制备中,NIBRG-14是世界卫生组织(WHO)推荐使用的一株H5N1流感疫苗株,其表面抗原基因来自A/Vietnam/1194/2004(H5N1)(VN1194),但研究表明实验室研究表明NIBRG-14的抗原性、免疫原性和鸡胚生长特性均可满足其作为疫苗株的要求,但该疫苗株在鸡胚中生长不佳, HA抗原产量通常较低。本研究以VN1194毒株的NA基因为研究对象,以提高疫苗株产量为目的,证明了包装信号的恢复能够有助于提高病毒产量。我们研究发现,在PR8背景下,VN1194NA基因被包装入重组病毒中的效率仅为正常包装量的38%-68%,因此推测有一部分重组病毒为不含有NA vRNA的缺陷型病毒粒子.我们在VN1194 NA基因完整CDS的5’和3’两端嵌合PR8 NA基因包装信号序列(vRNA 3’末端41bp,5’末端67bp),通过反向遗传操作成功拯救了不同HA和NA组合的4株重组病毒,分别命名为PR8HA-PR8(21/39)VNNA、PR8HA-VNNA、VNHA-PR8(21/39)VNNA、VNHA- VNNA。从包装效率分析,RNA凝胶电泳直观的表明,相较疫苗株,恢复了包装信号的病毒NA基因包装效率有了很大提高。通过荧光定量PCR,更加精确的从分子水平证明了包装信号的添加能使NA的包装效率从38%-68%增加到101%~103%,重组病毒中NA vRNA的包装效率得到完全恢复。我们以相同EID50接种鸡胚,每12h取样在MDCK进行滴度测定,绘制生长曲线,我们发现恢复包装信号的病毒在鸡胚的生长滴度提高了10倍。从HA抗原产量分析,以相同EID50接种鸡胚,通过纯化病毒的SDS-PAGE,用BandScan5.0分析HA的含量,结果表明恢复包装信号的病毒其HA抗原含量提高了约2.7倍。总之,本文就PR8 NA基因包装信号序列对异源NA基因的包装效率、重组毒株的生长特性以及HA抗原含量的影响进行了探讨,为提高H5N1流感疫苗株的产量提供了解决方案,为疫苗的研制提供了新的思路。