肾综合征出血热（hemorrhagicfeverwithrenalsyndrome，HFRS）是由汉坦病毒（hantavirus，HV）引起，由鼠类等传播的一种急性病毒性传染病，临床上以发热、出血和急性肾功能损害为主要特征。尽管已经有大量关于预防汉坦病毒方面的研究，但是至今仍然没有有效可行的特异性治疗方案以及经过WHO认证的汉坦病毒疫苗。我国是HFRS疫情最严重的国家，因此对其防治就显得尤为重要。国内外现已研制出了两类HFRS灭活疫苗，即纯化乳鼠脑灭活疫苗和细胞培养灭活疫苗。这对HFRS疫情的控制和预防起了重要的作用，但是仍然其存在着诸多不足，主要是诱导机体产生中和抗体的能力较弱，也不能有效地刺激细胞免疫应答，对人群的免疫持久性欠佳，通常需要反复接种，并且生产成本相对较高等。因此，研制新型HFRS疫苗显得刻不容缓。　　汉坦病毒的囊膜糖蛋白（Glycoprotein，GP）是汉坦病毒M基因编码的重要结构蛋白，具有病毒毒力位点、细胞结合位点、中和抗原决定簇及特异性抗原位点等，是诱导免疫反应的主要因素，能诱导机体产生中和抗体，但其免疫原性较弱；核衣壳蛋白（Nucleocapsidprotein，NP）有很强的抗原性和免疫原性，NP不仅具有多个线性抗原位点，而且存在有中和抗原位点，此外也有实验证实汉坦病毒NP在诱导机体细胞免疫应答中也起重要作用。我室前期研究发现，NP的抗原位点主要位于汉坦病毒S基因0.7kb片段（即编码NP氨基端aa1～274片段，S0.7）上，且该截短片段与完整NP对机体的免疫效果基本相同；在此基础上，本室前期构建了含汉坦病毒S基因0.7kb片段与M基因的嵌合基因重组腺病毒（rAd-G1S0.7、rAd-G2S0.7），发现上述嵌合基因表达的融合蛋白能有效地刺激机体的体液免疫应答以及部分细胞免疫应答，且其效果均高于非嵌合组。为了进一步提高该嵌合基因融合蛋白的表达量，本室对腺病毒载体进行了改建，即将其启动子替换为CAG（人CMV增强子和b-actin启动子的杂合体）启动子，构建了新的重组腺病毒（rAd-G1S0.7-pCAG、rAd-G2S0.7-pCAG），经免疫学实验证明，与先前的重组腺病毒rAd-G1S0.7、rAd-G2S0.7相比，新构建的重组腺病毒能显著提高嵌合基因的表达水平。为了进一步促进嵌合基因蛋白的加工和提呈，本室在重组腺病毒嵌合基因（rAd-G1S0.7-pCAG、rAd-G2S0.7-pCAG）上分别添加了HSP70蛋白C末端基因（HSP70C）和泛素蛋白基因（Ub）两种抗原加工递呈分子（有研究证明HSP70的C末端可完全替代完整HSP70发挥佐剂功效），构建了新的四组重组腺病毒（rAd-G1S0.7-pCAG-HSP70C、rAd-G2S0.7-pCAG-HSP70C、rAd-Ub-G1S0.7-pCAG、rAd-Ub-G2S0.7-pCAG），并对其做了初步的鉴定，结果证实新构建的重组腺病毒能很好的表达融合目的蛋白、HSP70C蛋白及Ub蛋白。　　本课题拟在前期的工作基础上，对以上构建的含汉坦病毒嵌合基因G1/G2-S0.7-HSP70C、Ub-G1/G2-S0.7进行免疫学特性研究，并对其进行初步的动物保护试验分析。　　1、将各组重组腺病毒经过扩增、纯化及滴度测定后，腹腔注射免疫C57BL/6小鼠，同时设立阳性对照组（双价肾综和征出血热纯化疫苗）、阴性对照组（Adenovirus）和正常小鼠对照组（生理盐水）。通过ELISA、微量细胞培养中和试验、ELISPOT及CTL细胞杀伤实验研究各组重组腺病毒的免疫学特性。ELISA检测结果显示：实验组小鼠血清1:40稀释均可检测到特异性抗NP抗体，其中rAd-G1S0.7-pCAG、rAd-G1S0.7-pCAG-HSP70C和rAd-G2S0.7-pCAG-HSP70C的效价均为1:160，疫苗对照组效价为1:320；微量细胞培养中和试验检测结果显示，各重组腺病毒免疫小鼠血清中均可检测到中和抗体，其中rAd-G1S0.7-pCAG-HSP70C免疫组中和效价（1:40），高于其他改建及未改建重组腺病毒（1:5～1:20），疫苗对照组中和抗体效价为1:20，腺病毒和正常小鼠对照组未检测到中和抗体；ELISPOT检测结果显示rAd-G1S0.7-pCAG、rAd-G1S0.7-pCAG-HSP70C以及rAd-G2S0.7-pCAG-HSP70C免疫组的IFN-γ水平高于其他重组腺病毒免疫组及疫苗对照（P<0.05），rAd-G1S0.7-pCAG免疫组的IL-2水平高于其他重组腺病毒免疫组及疫苗对照组（P<0.05），rAd-G1S0.7-pCAG-HSP70C、rAd-G2S0.7-pCAG-HSP70C分泌IL-4水平高于其他重组腺病毒免疫组及疫苗对照组（P<0.05），所有重组腺病毒免疫组及疫苗对照组的IL-10分泌水平无显著差异（P>0.05）；CTL细胞杀伤实验检测结果显示，各重组腺病毒免疫组在不同的效靶比条件下，均可诱发T细胞介导的特异性杀伤作用，且杀伤效应随着效靶比值升高而增强，效靶比为100:1时，rAd-G1S0.7-pCAG和rAd-G1S0.7-pCAG-HSP70C重组腺病毒免疫组诱导的杀伤效应高于含嵌合基因G1S0.7的其他重组腺病毒免疫组及疫苗组（P<0.05），rAd-G2S0.7-pCAG和rAd-G2S0.7-pCAG-HSP70C重组腺病毒免疫组诱导的杀伤效应高于含嵌合基因G2S0.7的其他重组腺病毒免疫组（P<0.05），但是与疫苗对照组无显著差异（P>0.05）。　　2、在各重组腺病毒第三次接种C57BL/6小鼠10天后将HTNV76-118病毒通过肌肉注射入各组小鼠体内，3天后取出各组小鼠肝脏和脾脏，制成组织悬液，用ELISA双抗体夹心法检测待测组织中的HTNV抗原。ELISA检测结果显示：各重组腺病毒免疫组对小鼠的肝脏和脾脏均有一定的保护作用，rAd-G1S0.7-pCAG和rAd-G1S0.7-pCAG-HSP70C对小鼠的肝脏和脾脏的保护作用优于其他重组腺病毒（P<0.05），而与疫苗无显著性差异（P>0.05）。综合免疫学试验和动物保护实验结果，我们可以得出以下结论：rAd-G1S0.7-pCAG、rAd-G1S0.7-pCAG-HSP70C和rAd-G2S0.7-pCAG-HSP70C免疫组小鼠的体液免疫应答水平高于其他重组腺病毒免疫组；rAd-G1S0.7-pCAG、rAd-G2S0.7-pCAG、rAd-G1S0.7-pCAG-HSP70C和rAd-G2S0.7-pCAG-HSP70C免疫组小鼠的细胞免疫应答水平高于其他重组腺病毒免疫组。动物保护实验结果表明，rAd-G1S0.7-pCAG与rAd-G1S0.7-pCAG-HSP70C对小鼠的保护作用高于其他重组腺病毒免疫组。下一步，我们将rAd-G1S0.7-pCAG、rAd-G2S0.7-pCAG、rAd-G1S0.7-pCAG-HSP70C和rAd-G2S0.7-pCAG-HSP70C作为候选疫苗进行药代动力学试验，长期毒性试验和急性毒性试验。本研究为备选疫苗进入临床研究并最终为研制出有效的、可达到中试开发水平的新型肾综合征出血热重组腺病毒疫苗打下基础。