涎腺腺样囊性癌(salivary adenoid cystic carcinoma,SACC)是最常见的涎腺恶性肿瘤之一。嗜神经侵袭(perineural invasion,PNI)是SACC的一个显著生物学特征。由于SACC易侵犯神经并沿神经浸润及远处转移,使手术范围难以掌握,加上SACC对化疗不敏感,导致SACC治疗难度较大,患者预后较差。研究表明,在神经以及多种恶性肿瘤中高表达并分泌C-C模体趋化因子配体2(C-C motif chemokine ligand 2,CCL2)。CCL2又称单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-1,MCP-1),可通过激活其受体:C-C模体趋化因子受体2(C-C motif chemokine receptor2,CCR2),由CCL2/CCR2分子轴促进肿瘤细胞的侵袭及转移等过程。CCL2还可通过CCL2/CCR2分子轴募集肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophages,TAMs),促进肿瘤的进展。然而,CCL2/CCR2分子轴以及TAMs在SACC嗜神经侵袭中的作用及机制尚未明了,有待深入研究。本实验包括以下四个部分:1.CCL2/CCR2分子轴在涎腺腺样囊性癌中的表达及临床意义目的:探究CCL2、CCR2、CD68以及CD163在SACC患者组织标本中的表达或者分布,并分析其与SACC嗜神经侵袭间的关系。方法:取71例SACC病理标本及50例正常涎腺组织。采用免疫组织化学染色方法鉴定并分析CCL2、CCR2、CD68以及CD163的表达;使用透射电镜观察并分析TAMs在SACC中的分布;采用流行病学方法分析CCL2、CCR2、CD68以及CD163的表达与SACC嗜神经侵袭、TNM分期、患者生存等的相关性。结果:CCL2、CCR2、CD68以及CD163在SACC组织中的表达显著高于正常涎腺组织;在SACC组织中,CCL2、CCR2的表达与CD68、CD163的表达水平显著相关;透射电镜下可见SACC组织中TAMs的浸润;CCL2、CCR2、CD68以及CD163的高表达与SACC的嗜神经侵袭、TNM分期以及患者不良预后显著相关。结论:CCL2、CCR2在SACC组织中高表达,可能与TAMs的募集密切相关;CCL2/CCR2分子轴及TAMs可能在SACC的嗜神经侵袭过程中发挥重要作用。2.CCL2/CCR2分子轴介导肿瘤-神经相互作用促进涎腺腺样囊性癌嗜神经侵袭的机制研究目的:探究CCL2、CCR2在肿瘤细胞-背根神经节(dorsal root ganglion,DRG)共培养体系中的表达,利用药物拮抗剂和RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术探究CCL2/CCR2分子轴是否介导肿瘤-神经相互作用及其可能机制。方法:取新生BALB/c小鼠DRG及SACC细胞系SACC-83与SACC-LM,构建肿瘤细胞-DRG共培养体系;采用ELISA、荧光实时定量PCR(q RT-PCR)及Western Blot分析共培养体系条件培养基与肿瘤细胞CCL2或CCR2的表达;采用CCR2 sh RNA慢病毒转染系统构建稳定下调CCR2的SACC-83细胞株;采用q RT-PCR、Western Blot、CCK8、Transwell迁移/侵袭实验探究不同浓度CCL2条件下,SACC-83细胞与DRG共培养,或者CCR2沉默条件下,SACC-83细胞p-ERK1/2、ERK1/2、MMP-2与MMP-9的表达以及增殖、迁徙、侵袭能力的变化;取新生BALB/c小鼠DRG及SACC-83细胞系构建体外SACC细胞嗜神经侵袭模型。采用药物拮抗剂或者慢病毒转染RNAi技术探究阻断CCL2/CCR2分子轴对SACC细胞嗜神经侵袭能力的影响。结果:DRG高表达CCL2,激活SACC-83细胞或者SACC-LM细胞CCR2的表达;CCL2/CCR2分子轴可激活SACC-83细胞ERK1/2信号通路,并调控MMP-2、MMP-9的表达,促进SACC-83细胞的迁移及侵袭能力;通过药物拮抗剂或者慢病毒转染RNAi技术阻断CCL2/CCR2分子轴均可显著抑制SACC-83细胞的嗜神经侵袭。结论:神经可能通过分泌CCL2,由CCL2/CCR2分子轴激活肿瘤细胞ERK1/2信号通路,及MMP-2、MMP-9的表达,促进SACC的嗜神经侵袭。3.CCL2/CCR2分子轴募集肿瘤相关巨噬细胞促进涎腺腺样囊性癌侵袭能力的机制研究目的:探究CCL2/CCR2分子轴是否参与调控SACC细胞及肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)间的相互作用及可能机制,明确TAMs对SACC细胞增殖、侵袭能力的影响及可能机制。方法:使用佛波酯(phorbol 12-myristate 13-acetate,PMA,100 n M,24 h)诱导THP-1细胞分化为巨噬细胞,并构建SACC-83细胞与巨噬细胞的Transwell共培养体系,以探究SACC细胞与TAMs的相互作用;采用ELISA、q RT-PCR及Western Blot实验分析共培养体系条件培养基CCL2的表达,以及肿瘤细胞与巨噬细胞CCL2或CCR2的表达;采用慢病毒转染RNAi技术构建稳定下调CCL2的SACC-83细胞株;采用q RT-PCR以及Western Blot实验探究SACC-83细胞CCL2沉默条件下,共培养的巨噬细胞CCR2的表达情况;采用Transwell迁移实验分析SACC-83细胞条件培养基对巨噬细胞迁移能力的影响;使用CCR2特异性阻滞剂RS504393(50 ng/m L)抑制巨噬细胞CCR2的表达,分析阻断CCL2/CCR2分子轴后SACC-83细胞条件培养基对巨噬细胞迁移能力的影响;使用SACC-83细胞条件培养基诱导巨噬细胞48 h,得到TAMs;采用流式细胞术检测TAMs表面标志物CD163与CD206的表达变化,采用q RT-PCR及Western Blot实验分析TAMs的TNF-α、IL-1β、Arg1、IL-10以及GDNF分子的表达变化;使用RS504393(50 ng/m L)抑制TAMs的CCR2表达,分析阻断CCL2/CCR2分子轴后TAMs的CD163、CD206、TNF-α、IL-1β、Arg1、IL-10以及GDNF的表达变化;使用TAMs条件培养基诱导SACC-83细胞,48 h后采用Western Blot检测SACC-83细胞p-RET及RET的表达变化;在TAMs条件培养基中加入GDNF中和抗体(GDNF neutralizing antibody,GDNF Nab,2μg/m L)去除GDNF,或者对巨噬细胞应用RS504393(50 ng/m L),然后诱导SACC-83细胞,48 h后检测SACC-83细胞p-RET及RET的表达变化;采用CCK8、划痕以及Transwell迁移/侵袭实验分析TAMs条件培养基对SACC-83细胞增殖、迁移以及侵袭能力的影响;对SACC-83细胞应用RET抑制剂pyrazolo-pyrimidine-1(PYP1,5μM),或者对巨噬细胞应用RS504393(50 ng/m L),探究阻断GDNF受体RET,或者阻断CCL2/CCR2分子轴后,TAMs条件培养基对SACC-83细胞增殖、迁移以及侵袭能力的影响。结果:SACC-83细胞来源CCL2可激活TAMs的CCR2的表达;SACC-83细胞通过CCL2/CCR2分子轴促进TAMs的CD163、CD206、Arg-1、IL-10以及GDNF的表达,然而抑制TNF-α以及IL-1β的表达;TAMs通过GDNF/RET通路促进SACC-83细胞的增殖、迁移以及侵袭能力。结论:SACC细胞可能通过CCL2/CCR2分子轴募集TAMs,促进SACC细胞的侵袭。其机制可能是:SACC细胞通过CCL2/CCR2分子轴诱导TAMs的“M2表型转化”,并促进TAMs的GDNF的表达;同时,TAMs通过GDNF/RET通路促进SACC细胞的增殖、迁移及侵袭能力。4.CCR2阻滞剂抑制涎腺腺样囊性癌嗜神经侵袭的动物实验研究目的:探究通过对荷瘤裸鼠应用CCR2阻断剂以阻断CCL2/CCR2分子轴,能否抑制SACC的嗜神经侵袭。方法:在靠近裸鼠坐骨神经处接种SACC-83细胞以建立SACC嗜裸鼠坐骨神经侵袭模型;肿瘤细胞接种后1周,裸鼠经口用药RS504393(30 mg/kg),3天用药一次,连续用药4周,肿瘤细胞接种满5周后处死动物。分析用药后肿瘤体积、坐骨神经功能障碍及神经肿胀程度。结果:裸鼠应用CCR2阻断剂后可显著抑制肿瘤的体积、坐骨神经功能障碍以及神经肿胀程度。结论:应用CCR2阻断剂可抑制SACC嗜神经侵袭,可能为治疗SACC的嗜神经侵袭提供新的策略。