阿尔茨海默病(Alzheimers disease，AD)是一种常见于老年人的中枢神经系统退行性疾病，以进行性认知功能障碍和记忆力减退为主要表现，其主要的病理改变是在边缘叶及相关皮质有老年斑(senile plaque，SP)沉积、神经元纤维缠结(neurofibrillary tangles，NTFs)形成及神经元丢失。在其病因的探索方面，科研工作者也提出了许多种假说。1994年，Sparks首次证明使用高胆固醇饮食饲喂兔6-8周后，与对照组比较脑内β-淀粉样蛋白生成明显增多，而且众所周知胆固醇还与常见的心脑血管疾病有密切的联系，因此引发了胆固醇与AD的研究热潮。后续的用转基因鼠进行的实验亦证明，高胆固醇可加重转基因鼠脑内AD的病理改变。 在患AD的老年人中，女性占有较大比例，排除教育程度高低等因素外，女性患病率仍为男性的1.5-3.0倍。而老年女性最大的生理特点就是绝经，雌激素撤退。这给了我们一个提示：是否雌激素对AD有保护作用呢。经过近年研究，得出的结论并不一致，一些研究资料表明绝经妇女使用雌激素替代疗法(ERT)可有效降低或延缓AD的发病，另一些得到的却是阴性结果。临床上对雌激素使用剂量也还需要进一步的研究，避免长期使用带来的不良反应。 本研究通过去卵巢、胆固醇过载大鼠模型的建立，以及观察植物雌激素对该模型的影响。探讨胆固醇和雌激素对Aβ生成的影响，为AD的雌激素缺乏-胆固醇过载假说提供实验室证据，并为雌激素在AD治疗中可能的有益作用提供新资料。 1、材料和方法 1.1实验对象、来源及分组 实验用雌性SD大鼠购自广东省实验动物中心，共40只，观察其初始精神状态和活力均良好，体重(180±3.2g)。随机分为五组：对照组(Control)，去卵巢组(Ovx)，高胆固醇组(HChol)，模型组(Ovx+HChol)，植物雌激素治疗组(Ovx+HChol+E)，每组8只。大鼠经去卵巢手术后恢复1.2周开始进食高胆固醇饲料。高胆固醇饲料配方：胆固醇2％+猪油10％+胆酸钠0.3％+普通鼠料粉88.7％。植物雌激素治疗组给药：250μg金雀异黄酮(溶于50μ1二甲基亚砜)，腹部皮下注射，每隔2d注射1次，注射18周。 1.2 Morris水迷宫行为学测试 饲喂16周后，每组随机选出5只鼠，行Morris水迷宫试验，以检测行为学方面的变化。包括定位航行测试和空间探索测试。 1.3 RT-PCR检测 海马APP、BACE1的mRNA水平；夹心ELISA法检测大鼠海马脑匀浆的Aβ40含量水迷宫试验后休息一周，各组随机选取5只大鼠处死取双侧海马，一侧用来提总RNA，做半定量RT-PCR检测APP、BACE1的mRNA水平，另一侧加8倍脑组织质量的裂解液匀浆，匀浆液室温静置3-4h待其充分裂解后，加BSAT-DPBS稀释后，在4℃下 16000转离心20min，取上清。各个上清液用考马斯亮蓝方法测总蛋白浓度，然后调整各个样品上清的总蛋白浓度一致，备做央心ELISA检测。 1.4 Aβ40抗体免疫组化染色 各组另3只大鼠继续饲喂至20周后，灌注取脑，梯度蔗糖溶液脱水，冰冻切片，厚度为30μm，24孔板收集脑片，备做漂片法免疫组化。观察并计数Aβ40阳性神经元数，1.5统计学分析所得数据结果用均数±标准差(-x±s)表示，利用SPSS11.0统计软件分析，P<0.05认为有统计学意义。计量资料多组均数比较采用方差分析。 2、结果 2.1 Morris水迷宫行为学测试 定位航行实验用平均逃避潜伏期来判断实验动物的参考记忆能力。在8个blocks测试中，各组大鼠的平均逃避潜伏期均随着测试次数的增加而缩短。前2d时间段内平均逃避潜伏期下降明显，后2d趋于稳定。在第4天的测试中，Ovx+hchol组和Ovx+hchol+E组与其他三组比较，潜伏期明显延长(P<0.01)，但是这两组之间在平均潜伏期上的差异不明显，无统计学意义(P>0.05)；Hchol组的要比Control组和Ovx组在逃避潜伏期上有延长(P<0.05)；Control组和Ovx组之间无明显差异(P>0.05)。 空间探索实验，以平台象限游泳时间占总时间百分比和穿过平台次数判断动物的空间记忆能力。Ovx+hchol组和Ovx+hchol+E组大鼠平台象限(TQ)游泳时间占总时间百分比和穿台次数明显较其他三组小，差异具有统计学意义(P<0.01)，并且这两组间的差异也有统计学意义(P<0.05)；Hchol组和Ovx组比较，平台象限(TQ)游泳时间百分比较低，且差异有统计学意义(P<0.05)；Ovx组和Control组比较，TQ游泳百分比差异不明显，但是穿台次数比较有统计学意义(P<0.05)。 2.2 RT-PCR检测 海马APP、BACE1的mRNA水平统计结果分析显示在BACE1mRNA方面Control组、Ovx组和Hchol组间差异无统计学意义(P>0.05)，Ovx+hcho组和Ovx+hchol+E组有升高，与前述三组比较有统计学意义(P<0.05)。在APPmRNA方面，Ovx+hchol组、Ovx+hchol+E组及Hchol组与Control组、Ovx组相比较，差异有统计学意义(P<0.01)；Ovx+hcho组与Ovx+hchol+E组比较差别意义不大，但是这两组分别与Hcho组比较的，其差异均有统计学意义(P<0.05)。 2.3 夹心ELISA法检测 大鼠海马脑匀浆的Aβ40含量ELISA测得各组大鼠脑Aβ40含量(ng/mg wet tissue weight)为Control组(144.24±9.2)、Ovx+nor组(167.93±8.5)、Hchol组(217.51±9.2)、Ovx+hchol组(290.63±15.31)和Ovx+hchol+E组(240.77±11.4)。数据分析显示，饲料中含有胆固醇的Ovx+hchol组、Ovx+hchol+E组、Hchol组脑海马Aβ40的含量明显高于饲料中不含有高胆固醇的Control组、Ovx组(P<0.01)；组间比较，Ovx+hchol组明显分别高于Ovx+hchol+E组和Hchol组，差异具有统计学意义(P=0.009和P=0.002)；Ovx+hchol+E组与Hchol组组间差异亦有统计学意义(P<0.05)；Ovx组与对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。 2.4 免疫组化检测 各组大鼠海马Aβ40免疫反应阳性神经元的变化免疫组化染色显示海马区神经元胞质呈棕黄色阳性着色，阴性对照在相对应区未见阳性着色。选取海马CA1区进行Aβ40免疫反应阳性细胞计数和相对灰度值比较。Ovx+hchol组、Ovx+hchol+E组及Hchol组阳性细胞计数及相对灰度值明显高于Control组(P<0.01)，且Ovx+hchol组与Ovx+hchol+E组、Hchol组相比，差异亦较明显(P<0.05)；Control组与Ovx组间的比较，后者数据虽有提高，但差异无统计学意义(P>0.05)。 3、结论 (1)成功建立了去卵巢胆固醇过载SD大鼠模型。其学习记忆行为能力减退、Aβ增加等方面都表现出拟AD样改变。 (2)饮食含高胆固醇组的APP的表达明显较正常饮食组增高，提示胆固醇过载是诱导脑内Aβ产生增多的原因之一。而BACE1的表达差异不明显，可能是胆固醇起到了调节其活性的作用。 (3)模型组的拟AD样病理改变较高胆固醇组的明显，提示内源性雌激素对胆固醇过载大鼠有一定的保护作用。 (4)植物雌激素有类雌激素样的保护作用。我们有必要进一步研究其剂量和选择合适的时间窗。