研究背景:在儿童时期,支气管哮喘(Bronchial asthma)是一种最常见的慢性呼吸道炎症疾病,支气管哮喘全球发病率逐年升高,在发达国家和发展中国家,儿童和成人哮喘发病患者总人数已上升到3亿以上,尤其是儿童哮喘,发病人数占35%以上,并且我国是支气管哮喘病死率最高的国家之一,造成了严重的医疗负担和社会负担。虽然近些年来《全球哮喘倡议指南》(GINA指南)得到很大的推广及应用,但是我国儿童哮喘控制情况仍然不尽如人意,哮喘儿童每年哮喘急性发作人数占全部患者人数的比率达66%,因此探寻支气管哮喘的发病机制是我们的重要任务。免疫学界认为支气管哮喘的发生与Th1/Th2平衡的破坏有重要关系,当变应原或其他因素进入哮喘患者体内后,过敏原可通过抗原呈递细胞激活气道黏膜上的T细胞,因此活化和促进Th2型气道炎症反应,产生IL-4、IL-10和IL-13等多种活性细胞因子,从而激活肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞及肺泡巨噬细胞等多种肺部炎症细胞,造成炎症细胞在气道中浸润和聚集。这些炎症细胞还能相互作用并且分泌出多种活性细胞炎症介质,从而成了一个相互作用的复杂免疫网络,从而导致气道平滑肌收缩,黏液分泌增加,血管通透性增加,炎症细胞浸润,产生气道高反应性及气道重塑等支气管哮喘病理生理特征。由于哮喘对儿童的严重不良影响,因此,获取有效的炎症评估指标及优质的抗哮喘药物一直是迫切需要解决的问题。目前已有许多研究证实,在支气管哮喘发病中,有多种类型的炎症细胞和细胞因子发挥了重要的作用。作为白介素17(Interleukin-17,IL-17)家族中的新成员,白细胞介素-25(Interleukin-25,IL-25)是一种免疫促炎性细胞因子,目前被公认在支气管哮喘的免疫功能方面发挥了十分重要的作用。IL-25在不同类型的肺细胞中表达增加,不仅包括肺结构细胞,如气道内皮细胞和上皮细胞,还包括嗜酸性粒细胞、T细胞和肥大细胞。当暴露于过敏原后,支气管粘膜下层的这些细胞会增加,并且分泌IL-25或对IL-25产生迅速的免疫反应。IL-25能活化Th2型细胞产生一系列免疫反应,可以产生Th2型细胞因子如IL-4、IL-10、IL-15等,也可以产生嗜酸性粒细胞趋化因子,从而导致血清特异性IgE升高和嗜酸性粒细胞的浸润。在活体模型中证实肺组织发生了明显的病理变化,IL-25能够引起气道炎症和气道重塑以及增强过敏性炎症反应。而通过阻断IL-25,气道高反应性和肺组织轻微的嗜酸性粒细胞浸润以及杯状细胞增生也得到了显著的改善。因此,IL-25在哮喘的发病中发挥了重要作用,受到研究者们的广泛的关注。诱导痰作为一种相对安全、无创的方法,可以通过分析痰液细胞组成和可溶性炎症介质来评价气道炎症。并且通过诱导痰细胞分析评价痰嗜酸粒细胞增多的百分比,能够直接评估气道炎症反应,是一种客观监测哮喘的方法。有研究者对哮喘儿童进行了痰细胞测定,发现不同的细胞组分可以介导不同炎症细胞,如中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞和巨噬细胞,产生的气道炎症,其中嗜中性粒细胞气道炎症占主导地位。最近的研究也得出结论,诱导痰的分析可以识别与肺功能参数、哮喘控制和体重指数(BMI)相关的不同“高细胞因子”模式。目前罕见对支气管哮喘患儿痰中IL-25(Sputum interleukin-25,SpIL-25)的研究报道,并且IL-25在儿童支气管哮喘气道炎症中的作用机制及对治疗的反应的机制尚不明确,我们通过对IL-25在支气管哮喘儿童痰液中的表达变化及作用机制研究,将为支气管哮喘的诊断及治疗提供新的临床思路及理论依据。研究目的:1.探讨哮喘儿童诱导痰液中IL-25浓度水平变化及其与血液中IL-25表达水平的相关性。2.探讨哮喘患儿诱导痰液IL-25表达水平和呼出气一氧化氮水平、肺功能、诱导痰细胞计数百分比等临床数据的相关性。3.在蛋白及基因水平探讨哮喘患儿痰液中IL-25表达水平与临床指标及抗哮喘治疗效果的相关性,探索IL-25是否可作为一种炎症介质评估治疗效果。研究方法:1.研究对象及分组:选择2013年6月至2016年12月于山东大学齐鲁儿童医院确诊为支气管哮喘的儿童62例,他们为为轻-中度哮喘患者,男29例,女33例,年龄6～18岁。所有患者诊断均符合《全球哮喘倡议指南》诊断标准。选取18例(女8例,男10例)年龄匹配的非哮喘健康儿童作为对照组,纳入研究儿童要求能够独立完成肺功能,并且所有受试者的FEV1>预测值的75%。哮喘儿童根据其抗哮喘药物的使用分为A组:未接受抗哮喘药物治疗的未控制的哮喘儿童;B组:应用抗哮喘药物治疗控制哮喘儿童。2.完善临床指标的测试及标本收集,包括采用德国耶格-8800肺功能仪测定儿童基线肺活量,进行乙酰胆碱激发试验及诱导痰试验;并且测定并收集研究人群呼出气一氧化氮(Fractional exhaled nitric oxide,FENO)水平、血清总免疫球蛋白E(Immunoglobulin E,IgE)、全血C反应蛋白(C-reactive protein,CRP)、外周血嗜酸性粒细胞计数等数据。3.采用ELISA(Enzyme linked immunosorbent assay)方法检测血清及诱导痰液上清液IL-25水平表达变化。4.采用免疫印迹法(Western blot)检测诱导痰液中IL-25蛋白表达。5.采用qRT-PCR法检测研究对象血液及诱导痰液IL-25基因表达水平。研究结果:1.支气管哮喘儿童痰液IL-25水平与临床指标的相关性检测1.1血清及痰液中IL-25水平变化通过ELASE方法检测IL-25水平发现,A组诱导痰液中IL-25水平为(47.16±13.50 pg/ml)显著升高(P<0.001),明显高于其他两组(B组39.14±9.03 pg/ml,对照组36.76±6.48 pg/ml),A组和B组诱导痰IL-25浓度水平和血清中IL-25水平显著相关(A组r=0.669,P<0.01;B组r=0.576,P<0.05)。1.2诱导痰中细胞计数通过对诱导痰液细胞计数发现,A组哮喘儿童的诱导痰嗜中性粒细胞计数百分比下降(P<0.001),而嗜酸性粒细胞的计数百分比显著增加(P<0.001)。A组患者诱导痰液嗜酸性粒细胞和中性粒细胞计数百分比与诱导痰液IL-25水平呈正相关(分别为r=0.886,P<0.01;r=0.655,P<0.01)。1.3肺功能检测结果通过对入选儿童肺功能测定发现,在A组中,SpIL-25水平与FEV1(pred)(r=0.956,P<0.01)和PC20(mg/ml)(r=0.549,P<0.05)具有显著相关性。1.4 FENO检测结果通过对入选儿童FENO检测发现,A组哮喘患者的FENO水平明显升高(P<0.001)。A组血清SpIL-25水平与FENO水平具有相关性(r=-0.77,P<0.01)。我们发现哮喘儿童SpIL-25水平与血液IL-25水平(r=0.669,P<0.01)、FENO(r=-0.483,P<0.05)和嗜酸性粒细胞(r=0.405,P<0.05)均具有相关性。1.5肺功能、诱导痰液细胞计数与诱导痰液IL-25水平相关性分析通过统计分析发现哮喘儿童的FEV1/FVC%预测值、FEF25-75%的预测、诱导痰巨噬细胞(%)CRP与诱导痰液IL-25浓度水平无相关性。2.0支气管哮喘儿童诱导痰液IL-25蛋白及基因的表达2.1诱导痰液IL-25蛋白表达通过Western blot方法检测发现,各研究组诱导痰中IL-25蛋白表达水平不同。通过对比蛋白表达的比值,支气管哮喘儿童IL-25蛋白的表达水平明显增加,A组表达水平最高,表达量最多。与B组和健康对照组相比,A组诱导痰中IL-25蛋白水平的比值显著升高(P<0.001)。2.2诱导痰液IL-25mRNA表达2.2.1实时荧光定量qRT-PCR结果显示3组儿童血液及诱导痰液IL-25mRNA的相对表达量的总体均数具有显著统计学差异(P均<0.001)。A组中诱导痰液和血液IL-25的相对表达量均高于B组和健康对照组(分别P<0.05;P<0.001)。2.2.2诱导痰液和血液中IL-25mRNA表达水平相关性分析显示A组和B组支气管哮喘患儿IL-25mRNA表达呈线性相关、表达水平存在显著差异性。两组患儿诱导痰液和血液中IL-25mRNA的表达呈线性相关性(r=0.379,F=68.3,P=0.009)。A组患者诱导痰液和血液IL-25mRNA的相对表达量明显高于B组(P<0.05)和健康对照组(P<0.001)。B组患者和健康对照组相比无显著统计学差异(P=0.168)。2.2.3哮喘患儿LI-25mRNA的表达水平与病情严重度和抗哮喘治疗分组相关性分析结果哮喘患儿血液和痰液LI-25mRNA的表达水平与哮喘患儿疾病严重程度具有显著差异性(分别P=0.04和P=0.042);经过抗哮喘治疗,哮喘患儿血液和痰液LI-25mRNA的表达水平均显著下降(分别P=0.021和P=0.026),提示IL-25可以作为评估哮喘疾病严重程度和抗哮喘治疗效果的一种炎症介质。2.2.4哮喘息儿痰液LI-25mRNA的表达水平与血液CRP、FENO、FEV1/FVC(%)及诱导痰液嗜酸性粒细胞计数(%)相关性分析显示统计分析发现,支气管哮喘患儿痰液LI-25mRNA的表达与血液CRP水平相关性(r=0.361,P=0.007);哮喘患儿痰液LI-25mRNA的表达水平与哮喘患儿呼出气NO水平具有线性相关(r=0.26,P=0.04);哮喘患儿FEV1/FVC(%)和痰液LI-25mRNA的表达呈负相关性(r=-0.344,P=0.01),痰液IL-25mRNA在支气管哮喘患儿中的表达与诱导痰液嗜酸性粒细胞计数(%)具有显著相关性(r=0.404,P=0.03),提示IL-25可以作为一种炎症介质用来评估哮喘儿童气道炎症。结论:1.支气管哮喘儿童的诱导痰液和血液IL-25浓度升高,同时IL-25的表达在蛋白及基因水平明显升高。2.哮喘儿童痰液IL-25浓度水平和血液IL-25浓度水平、FENO、诱导痰嗜酸性粒细胞计数具有线性相关性。3.哮喘儿童诱导痰液LI-25mRNA的表达水平与血液CRP、FENO、FEV1/FVC(%)及诱导痰液嗜酸性粒细胞计数(%)、病情严重程度和抗哮喘治疗有明显相关性。4.诱导痰中IL-25水平在抗哮喘治疗后在浓度水平下降,同时在蛋白及基因水平也明显下降,提示IL-25表达水平能够作为评估药物疗效和哮喘控制状态的重要生物标志物。