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背景和目的肺动脉高压(PAH)是以肺循环阻力进行性升高、肺动脉重构为特征,最终导致右心功能衰竭和死亡的一种致命性疾病。肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)异常增殖和迁移是肺动脉重构的主要构成部分,抑制其异常增殖、迁移可有效逆转肺动脉重构,从而降低肺循环阻力。Warburg效应,又称有氧糖酵解,是指在有氧条件下糖酵解途径明显增强,表现为葡萄糖摄取增加,乳酸生成增加。最新研究显示Warburg效应在PAH发生发展中期重要作用,然而Warburg效应是否介导肺动脉平滑肌细胞异常增殖及其触发机制尚不清楚。血小板源性生长因子(PDGF)是受体酪氨酸激酶家族一员,已经研究发现PDGF及其下游的信号通路参与恶性肿瘤细胞的Warburg效应调节,同时,也有研究表明PAH患者和动物组织模型中PDGF表达显著上调,并且PDGF促PASMCs增殖伴随着乳酸生产的增加,据此提出Warburg效应介导PDGF促进PASMCs增殖的假说。本课题拟分离培养SD大鼠的PASMCs,分析PDGF受体及其相关信号通路阻滞,Warburg效应阻滞对PASMCs增殖的影响,进一步了解Warburg效应是否介导PDGF促进PASMCs增殖,PDGF通过何种信号通路调节PASMCs的Warburg效应,从而揭示Warburg效应在PAH发生发展中的作用和机制。方法(1)PASMCs的分离培养与鉴定:I型胶原酶消化法体外分离培养PASMCs。无菌条件下,分离提取SD大鼠的肺动脉主干及左右肺动脉干,剥离外膜、剔除内膜,经酶消化后,体外培PASMCs。在倒置显微镜下观察PASMCs生长状态以及形态特点;使用免疫细胞染色法对平滑肌α-actin肌动蛋白(α-SM actin)进行鉴定。(2)MTT、Western blot测定PASMCs增殖:用不同浓度(0、5、10、15 ng/mL)PDGF处理PASMCs不同时间(0、6、12、24 h),MTT法检测细胞的增殖率、Western blot检测增殖细胞核抗原(PCNA)蛋白的表达量。(3)Warburg效应的测定:?实验分组:设立空白对照组(即Control组)、PDGF组、PDGF+PDGF受体抑制剂Imatinib、PDGF+PDGF受体抑制剂Sorafenib、PDGF+Warburg效应抑制剂2-DG、PDGF+Warburg效应抑制剂DCA;?指标检测:试剂盒法检测胞外葡萄糖的摄取量,胞外乳酸的生成量,以及胞内ATP的生成量;Western blot检测Warburg效应关键酶Glut1,Glut4,MCT4,PDH,LDH,PCNA的表达量;MTT法检测细胞的增殖率。(4)信号通路的研究:?实验分组:设立空白对照组(即Control组)、PDGF组、PDGF+PI3K抑制剂、PDGF+mTOR抑制剂;?指标检测:试剂盒法检测胞外葡萄糖消耗量,胞外乳酸生成量,以及胞内ATP生成量;Western blot检测Warburg效应关键酶Glut1,Glut4,MCT4,PDH,LDH,PDK1,PCNA,HIF-1α的表达以及PI3K,AKT,mTOR总蛋白量、磷酸化水平;MTT法检测细胞增殖率。结果(1)I型胶原酶消化法分离培养的PASMCs,3天后可以发现PASMCs贴壁并且呈梭形的状态生长,7天后生长迅速,12天后达90%融合。通过形态学观察及免疫组织化学染色法鉴定表明:培养的细胞为PASMCs。(2)PASMCs的增殖率、PCNA蛋白表达量随PDGF处理浓度增加而增加(P<0.05);PASMCs的增殖率、PCNA蛋白表达量随PDGF处理时间增加而增加(P<0.05)。(3)与未加PDGF的Control组相比,15 ng/mL的PDGF能明显增加胞外葡萄的摄取量,乳酸的生成量,促进Glut1,Glut4,MCT4,LDH的表达(P<0.05),明显降低胞内ATP的生成量,抑制PDH的表达(P<0.05);与PDGF组相比,加入PDGF受体抑制剂Imatinib和Sorafenib后,能明显减少PDGF诱导的胞内葡萄的摄取量,乳酸的生成量,以及抑制PDGF诱导的Glut1,Glut4,MCT4,LDH的表达(P<0.05),同时,明显增加ATP的生成量,以及促进PDH的表达(P<0.05);与PDGF组相比,PDGF受体抑制剂Imatinib和Sorafenib,及Warburg效应抑制剂2-DG和DCA能明显抑制PDGF诱导的PASMCs增殖(P<0.05)。(4)与未加PDGF的Control组相比,15 ng/mL的PDGF能明显增加PI3K,AKT,mTOR磷酸化水平(P<0.05);与PDGF组相比,PDGF受体抑制剂Imatinib和Sorafenib明显抑制PDGF诱导的PI3K,AKT,mTOR磷酸化(P<0.05),Warburg效应抑制2-DG和DCA对PDGF诱导的PI3K,AKT,mTOR磷酸化无明显抑制作用;与PDGF组相比,PI3K和mTOR抑制剂明显减少PDGF诱导的葡萄消耗量,乳酸生成量,以及抑制Glut1,Glut4,MCT4,LDH,HIF-1α,PDK1的表达量(P<0.05),同时能明显增加PDGF诱导的ATP的生成量,以及增加PDH的表达(P<0.05);与PDGF组相比,PI3K和mTOR抑制剂能明显抑制PDGF诱导的PASMCs增殖(P<0.05)。结论1.PDGF促PASMCs增殖伴随Warburg效应的增强2.PDGF通过PI3K/AKT/mTOR/HIF-1α/PDK1途径增强Warburg效应促进肺动脉血管平滑肌细胞增殖