第一部分SD大鼠骨髓间充质干细胞提取、培养以及鉴定研究目的:建立SD大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）的提取、纯化培养方法,并进行细胞形态学观察、多向分化能力检测以及干细胞免疫表型的测定。研究方法:采用SPF级雄性Sprague-Dawley大鼠（4-8周龄）作为实验研究对象。在无菌条件下分离大鼠的股骨和胫骨,用提前预冷的培养液冲洗骨髓腔,通过改良后全骨髓贴壁培养法将冲出的骨髓吹散后均匀接种到培养瓶中,经过接种后频繁换液以及传代时控制胰蛋白酶的用量和消化时间,达到BMSCs的纯化。观察BMSCs的细胞形态学的变化,并通过流式细胞仪检测细胞表面分子标志物的表达。取生长状态良好的第三代（P3）骨髓间充质干细胞,暴露于不同的诱导培养基中,检测干细胞三系分化能力（成骨,成脂肪,成软骨）。研究结果:分离、纯化后的大鼠BMSCs以梭型、多边型细胞为主,呈典型旋涡状细胞集落且生长活跃。在成骨培养基诱导3周后,茜素红染色呈阳性。在成脂肪培养基诱导3周后,油红O染色呈阳性。在成软骨培养基诱导28天后,阿利新蓝染色呈阳性。流式细胞术检测分离所得细胞的干细胞表面抗原分子CD29、CD90均呈阳性表达（分别为99.88%和92.66%）,而CD45则呈阴性（为0.53%）。研究结论:采用改良后全骨髓培养法可以高效、简洁地获得均质性良好的大鼠BMSCs。该方法分离纯化培养的细胞在形态学、细胞表面标记物和分化潜能方面具有间充质干细胞的特征,经鉴定为大鼠骨髓间充质干细胞。第二部分线粒体自噬对BMSCs氧化应激凋亡的影响研究目的:体外模拟BMSCs移植后的氧化应激微环境,明确氧化应激对BMSCs凋亡以及线粒体自噬水平的影响,探究氧化应激微环境中线粒体自噬的激活及其在BMSCs凋亡过程中发挥的作用与最佳调控时间窗。研究方法:体外梯度浓度的H2O2处理BMSCs 24小时模拟氧化应激微环境,CCK-8检测其细胞活性,计算LD50,并以此浓度构建氧化应激诱导的BMSCs凋亡模型。流式细胞术及TUNEL染色检测细胞凋亡率;Western blot检测凋亡相关蛋白表达;免疫荧光观察线粒体自噬小泡;Western blot检测自噬相关蛋白的变化;流式细胞术及JC-1染色检测线粒体膜电位的变化情况;分别用线粒体自噬促进剂AMA和阻断剂CSA处理BMSCs后,采用Western blot检测自噬水平的变化;流式细胞术及TUNEL染色检测细胞凋亡率;流式细胞术检测线粒体膜电位的变化情况;Western blot检测凋亡相关蛋白表达的变化。研究结果:在氧化应激损伤早期,BMSCs线粒体自噬水平显著升高,线粒体膜电位（mt△ψ）维持在较高水平,细胞凋亡率较低;而长时间应激损伤后,线粒体自噬水平逐渐降低,mt△ψ大幅下降,凋亡相关蛋白明显上调,细胞凋亡率显著增高。在氧化应激损伤的同时给予线粒体自噬抑制剂后,在应激早期mt△ψ就开始显著降低,同时凋亡蛋白增加,细胞凋亡率明显升高;而在用线粒体自噬促进剂处理后,能够进一步增强氧化应激条件下细胞的线粒体自噬水平,并能够缓解应激损伤晚期mt△ψ下降程度,减少凋亡相关蛋白表达,进一步降低细胞凋亡率。研究结论:氧化应激损伤早期,BMSCs便启动线粒体自噬,清除功能失调的线粒体,维持线粒体的稳态,避免细胞凋亡;随着应激损伤时间延长,线粒体自噬途径受到抑制,线粒体损伤程度加重,加速细胞凋亡。因此在氧化应激损伤早期提高线粒体自噬水平,能够提高BMSCs氧化应激耐受性,避免细胞凋亡,起到保护细胞作用。第三部分氧化应激损伤时BMSCs通过线粒体自噬发挥抗衰老作用研究目的:通过构建体外氧化应激mt△ψ衰老模型,明确线粒体活性氧（mt ROS）的变化与线粒体自噬的激活,探索氧化应激损伤过程中,mt ROS与BMSCs衰老的关系,以及BMSCs氧化应激衰老过程中线粒体自噬发挥自我保护作用。研究方法:采用亚致死剂量H2O2处理BMSCs 1小时后换液,培养24小时构建氧化应激衰老模型。采用半乳糖苷酶染色观察细胞衰老情况并量化细胞衰老程度,Western blot检测衰老相关蛋白表达的变化,流式细胞术检测BMSCs凋亡率是否明显升高,以确认氧化应激诱导BMSCs衰老模型构建成功。免疫荧光观察线粒体自噬小泡生成情况,Western blot检测自噬相关蛋白的表达。Mito-Sox Red探针检测mt ROS的变化,JC-1染色观察mt△ψ的变化。用线粒体自噬抑制剂CSA处理BMSCs后,Western blot检测自噬相关蛋白的表达,免疫荧光观察自噬小泡生成情况。半乳糖苷酶染色后观察BMSCs染色程度并量化细胞老化率,Western blot检测衰老相关蛋白表达。Mito-Sox Red探针检测mt ROS的变化,JC-1染色观察mt△ψ的变化。研究结果:在H2O2处理后,半乳糖苷酶深染的BMSCs的数量明显增多,衰老相关蛋白p21、p16表达增加,而流式细胞术检测细胞凋亡率没有明显变化,表明氧化应激衰老模型构建成功。免疫荧光观察线粒体自噬小体数量增多,且自噬相关蛋白表达上调。Mito-Sox Red探针检测显示mt ROS增加,JC-1染色mt△ψ明显下降。在线粒体抑制剂CSA处理后,线粒体自噬水平显著下降,线粒体活性进一步增加,mt△ψ则大幅度下降,半乳糖苷酶染色的BMSCs数量显著增加,p21、p16蛋白表达也明显上调。研究结论:亚致死剂量H2O2处理BMSCs可以构建氧化应激衰老模型。BMSCs衰老过程中,线粒体mt ROS逐渐增多,线粒体受到损伤,启动线粒体自噬途径,清除受损的线粒体。当线粒体自噬途径被阻断后,线粒体受损程度加重,mt ROS大幅增加,细胞衰老程度进一步加深。说明BMSCs通过启动线粒体自噬,清除功能失调的线粒体,降低mt ROS,提高细胞氧化应激耐受性,避免其衰老。第四部分Pink1/Parkin介导的线粒体自噬对于BMSCs氧化应激衰老的影响研究目的:在BMSCs氧化应激衰老过程中,明确Pink1与Parkin的续惯激活顺序以及启动线粒体自噬具体的机制。阐明Pink1/Parkin介导的线粒体自噬在氧化应激诱导衰老过程中如何保护BMSCs。研究方法:亚致死剂量H2O2处理干细胞后,Western blot检测线粒体上Pink1和Parkin的表达。构建Parkin的慢病毒以降低Parkin的表达,检测线粒体自噬水平、衰老变化程度以及mt ROS和mt△ψ的变化情况。对照组与Parkin敲除组同时给予Parkin促进剂Sal,检测线粒体自噬水平、衰老变化程度以及mt ROS和mt△ψ的变化情况,以明确氧化应激诱导线粒体自噬的启动受到Parkin的调控;构建Pink1的慢病毒以降低Pink1的表达,免疫荧光和Western blot blot检测线粒体自噬水平变化,以及Parkin在线粒体上表达水平。半乳糖苷酶染色及Western blot blot检测衰老表型。JC-1染色检测mt△ψ,Mito-Sox Red检测mt ROS水平。在敲除Pink1的同时给予Parkin促进剂Sal处理后,检测线粒体自噬水平、衰老变化程度以及mt ROS水平和mt△ψ的变化情况,以明确Pink1对线粒体自噬和募集Parkin于线粒体上以及细胞衰老的作用。综合评价氧化应激损伤过程中,线粒体自噬的启动是否主要依赖于Pink1/Parkin信号通路的激活及对其BMSCs过早衰老的影响。研究结果:（1）BMSCs在氧化应激衰老过程中,线粒体上Pink1和Parkin表达均上调。（2）降低Parkin表达后,线粒体自噬水平和mt△ψ均明显降低,而mt ROS水平升高,BMSCs衰老程度加重。（3）使用Parkin促进剂Sal能够上调线粒体自噬水平,并减轻线粒体损伤程度和控制mt ROS含量,提示氧化应激诱导BMSCs线粒体自噬的启动依赖于Parkin的激活,起到保护细胞的作用。（4）降低Pink1表达后,线粒体自噬水平和mt△ψ均明显降低,而mt ROS水平升高,BMSCs衰老程度加重。（5）使用Parkin促进剂Sal并不能逆转这一趋势,提示Pink1的激活是线粒体自噬启动的首要条件,Parkin需要被Pink1募集在线粒体上方能启动自噬。说明BMSCs氧化应激衰老过程中,线粒体自噬的启动主要依赖于Pink1/Parkin信号通路的激活。研究结论:氧化应激能够激活Pink1,并在线粒体上招募Parkin,继而启动线粒体自噬途径。BMSCs通过启动Pink1/Parkin介导的线粒体自噬,清除功能失调的线粒体,维持线粒体代谢稳定,提高氧化应激耐受性,避免细胞过早衰老,发挥抗衰老作用。