S-亚硝基化修饰（S-nitrosylation）是一种蛋白质氧化还原修饰,在真核生物中参与调控生物体多种生命活动。细胞内S-亚硝基化修饰水平受到GSNOR（S-亚硝基化谷胱甘肽还原酶）的调控。本研究拟通过对稻瘟菌中编码GSNOR的同源蛋白ADH5的功能分析,揭示S-亚硝基化修饰在稻瘟菌中的生物学意义,通过S-亚硝基化修饰蛋白质组学分析寻找靶标蛋白,并结合对靶标蛋白的调控机制研究,来解析S-亚硝基化修饰调控稻瘟菌致病过程的分子机制。结果如下:（1）首先,分析S-亚硝基谷胱甘肽还原酶ADH5蛋白在稻瘟菌中的功能特性。ADH5基因编码一个有381个氨基酸的蛋白,该蛋白的N端包含一个ADH＿N乙醇脱氢酶结构域,C端包含一个ADH＿zinc＿N锌指结构域。稻瘟菌ADH5蛋白在不同物种中相对保守,与禾谷镰刀菌ADH5同源性最高,与多种病原真菌的同源性也相对较高。ADH5基因在附着胞成熟和侵染菌丝中后期表达水平相对较高,表明其可能在这两个过程中发挥重要作用。对ADH5基因进行敲除,获得两个表型一致的敲除体,并对敲除体进行了互补实验。采用生物素转换技术检测稻瘟菌内S-亚硝基化修饰水平,发现在Δadh5敲除体中修饰水平显著升高,表明ADH5负调控S-亚硝基化修饰水平。采用NO荧光探针（DAF-FM）检测发现,Δadh5营养菌丝和附着胞内NO均大量积累,表明ADH5可能参与细胞内NO水平的调控。通过亚细胞定位观察发现,ADH5蛋白主要定位于细胞质和线粒体,与其参与氧化还原修饰的功能相一致。（2）其次,揭示了S-亚硝基谷胱甘肽还原酶ADH5在稻瘟菌中的生物学功能。对敲除体Δadh5进行生物学表型分析发现,Δadh5菌丝营养生长减慢,产孢量严重下降,并产生畸形分生孢子。致病力分析发现,敲除体在大麦和水稻上致病力均显著降低,划伤接种后病斑扩展能力减弱。为进一步弄清Δadh5致病力减弱的原因,观察了敲除体附着胞和侵染菌丝等侵染结构的形成情况。发现Δadh5附着胞形成不受影响,但其内部的膨压降低,糖原和脂质体的代谢过程减慢,导致敲除体不能形成功能性附着胞,从而侵入寄主减慢。进一步分析发现,敲除体侵染菌丝在寄主内的扩展减慢,并导致寄主细胞内产生大量活性氧,表明敲除体可能无法清除寄主植物细胞产生的活性氧,从而限制了侵染菌丝的扩展。环境压力敏感性实验表明,敲除体对双氧水异常敏感,与上述结果一致。同时ADH5的敲除影响了稻瘟菌对不同碳源的利用,因此可能也影响了稻瘟菌利用寄主细胞营养,影响侵染菌丝扩展。综合以上结果表明,ADH5参与调控稻瘟菌功能性附着胞的形成,也参与调控稻瘟菌在寄主内对活性氧解毒和对寄主碳源利用过程。（3）最后,通过建立S-亚硝基化修饰蛋白组学技术,大规模鉴定了稻瘟菌S-亚硝基化修饰靶标蛋白。结合iodo TMT标记法和串联质谱分析,建立了稻瘟菌S-亚硝基化修饰靶标蛋白大规模鉴定技术。采用该技术,从稻瘟菌不同发育阶段和活性氧处理的样品中,成功鉴定到483个S-亚硝基化靶标蛋白的741个修饰位点。为深入探究S-亚硝基化修饰在稻瘟菌中的调控机制,将靶标蛋白在已发表的稻瘟菌致病相关蛋白进行搜索,发现了29个与致病相关的S-亚硝基化修饰蛋白,分别参与稻瘟菌附着胞形成和侵染菌丝扩展。其中与附着胞Septin环形成相关的4个Septins家族蛋白均为S-亚硝基化修饰的靶标蛋白。选取了SEP6作为代表进行S-亚硝基化修饰验证和功能分析。互作实验发现,SEP6蛋白与ADH5直接互作,且SEP6的S-亚硝基化修饰水平在Δadh5中显著升高。将SEP6蛋白的C144位点进行突变后,发现SEP6蛋白的S-亚硝基化修饰水平降低,表明该位点确实为SEP6的修饰位点。生物学表型分析发现,Δsep6/SEP6C144S菌株的致病力、生长速率、产孢量、侵染速率、划伤扩展均显著降低,这与Δsep6敲除体表型一致。亚细胞定位实验发现,GFP-Sep6C144S不能正常定位于Septin环,同时GFP-Sep6在Δadh5中也不能正常定位于Septin环,表明ADH5通过调控SEP6的S-亚硝基化修饰稳态来调控Septin蛋白的正常定位,从而影响其生物学功能。综上所述,本研究通过研究稻瘟菌ADH5蛋白的特性,该蛋白在稻瘟菌中的生物学功能以及S-亚硝基化修饰蛋白组学分析和靶标蛋白的验证,来揭示ADH5介导的S-亚硝基化修饰在稻瘟菌中的致病机制。