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背景根据《2014年中国卫生和计划生育统计年鉴》公布的结果,缺血性脑卒中依然是威胁我国国民健康的主要疾病之一。结合我国现阶段医疗情况,其具有发病率高、患病率高、致残率高和死亡率高的特点,给社会造成沉重负担[1]。而目前临床对于卒中的治疗主要是依靠组织型纤溶酶原激活物(t PA),但由于严格的治疗时间窗、出血风险及知情同意等诸多限制,绝大部分患者没有得到及时有效的治疗[2]。因此,研究缺血性卒中发生机制并寻找新的治疗措施成为亟需解决的问题。基质金属蛋白酶9(MMP9)作为基质金属蛋白酶(MMPs)超家族的成员之一,目前大量的研究证实其在被激活后通过参与细胞外基质(ECM)的降解过程,与肿瘤细胞的转移关系密切[3]。在中枢神经系统中MMP9被认为是与脑微血管疾病关系最为密切的酶之一[4]。有动物实验证实基质金属蛋白酶抑制剂可逆转缺血后紧密连接蛋白(TJP)的降解作用,使脑水肿程度明显减轻[5]。这一结果提示血脑屏障(BBB)组成成分的TJP与MMP9可能存在某种联系。而另一研究发现敲除MMP9基因的小鼠,脑缺血后的梗死容积显著降低[6]。此外,有试验通过腹腔内注射褪黑素使大鼠缺血再灌注损伤后脑内MMP9的水平明显降低,BBB破坏较轻,脑水肿程度改善[7]。这一系列结果说明,脑卒中后MMP9水平的升高与活化会促使TJP降解,引起BBB通透性改变导致脑水肿,加重脑组织损伤。而采取有效措施降低卒中后MMP9的表达与活化将有助于减轻TJP降解,从而缓解脑水肿,改善卒中转归。中枢神经系统在缺血再灌注损伤后有着错综复杂的调控机制,我科多年来致力于电针的脑保护作用研究,本课题组前期的实验结果证明:电针预处理的神经保护作用与脑组织内MMP9的水平与活性密切相关[8]。但对这一现象潜在的细胞分子转导机制尚不清楚,因此进一步探索电针预处理的脑保护机制将有助于发现新的治疗靶点。结合以上研究背景,本实验利用SD大鼠大脑中动脉阻塞(MCAO)模型,观察持续电针预处理后缺血区脑组织炎症反应—MMP9表达—TJP完整性—BBB通透性等一系列变化并初步探索其内在机制,希望能够对电针预处理诱导缺血耐受的机制有更深刻的认识,为针对MMP9治疗脑中风带来新的视角与契机。实验一、持续电针预处理对脑缺血再灌注损伤和BBB通透性的影响目的:验证持续电针预处理对脑缺血损伤的保护作用;观察预处理及缺血后BBB通透性和脑水含量变化情况。方法:①持续电针预处理的神经保护作用健康雄性SD大鼠32只,随机分4组:假手术组(Sham,n=8)、单纯电针预处理组(EA,n=8)、单纯缺血再灌注组(MCAO,n=8)及电针预处理复合缺血再灌注组(EA+MCAO,n=8)。MCAO组及EA+MCAO组大鼠行MCAO后2h恢复再灌注,于再灌注后48h进行神经行为学评分并处死取脑行TTC染色检测梗死容积。②电针预处理对脑缺血再灌后BBB通透性的影响健康雄性SD大鼠96只,随机分4组:Sham组(n=24)、EA组(n=24)、MCAO组(n=24)及EA+MCAO组(n=24)。再将每组随机分为4个批次,电针预处理5天、缺血2小时、再灌注48小时候后按不同要求取材。分别检测各组动物伊文斯蓝(Evans Blue,EB)在脑实质中的扩散、EB渗透率和脑水含量。其中EB于再灌注后的第46小时经尾静脉注入。结果:①持续电针预处理具有诱导脑缺血耐受的作用。与MCAO组相比,EA+MCAO组动物脑梗死容积减少,神经功能学评分有所改善(Ρ<0.05);②电针预处理减轻了BBB破坏,降低了脑水肿程度。相较于MCAO组,EA+MCAO组动物梗死侧脑组织内EB透过则明显减少(Ρ<0.05),同时EA+MCAO组大鼠梗死侧脑内脑水含量较MCAO组显著降低(Ρ<0.05)。结论:电针预处理能够诱导脑缺血耐受,这一作用的发挥与其保持缺血损伤后BBB完整性关系密切。实验二、电针预处理对脑缺血再灌注后MMP9表达和活性的影响目的:证实电针预处理能够通过降低缺血再灌后脑内MMP9的表达水平和活性发挥脑保护作用。方法:健康雄性SD大鼠72只,随机分为4组(n=18):Sham组、EA组、MCAO组及EA+MCAO组。于再灌注48h处死,按实验要求取梗死侧及对侧脑组织,使用免疫组织化学、免疫蛋白印记及明胶酶谱技术检测各组大鼠脑组织内MMP9的活性及表达情况。为了排除假阳性,在免疫组织化学方法检测中另设阴性对照组(Ab-)。结果:免疫组织化学、免疫蛋白印记及明胶酶谱试验均表明相较于MCAO组,EA+MCAO组大鼠在半暗带的皮层及纹状体区域MMP9的表达明显减少(Ρ<0.05),活性明显降低(Ρ<0.05)。而各组动物非梗死侧脑组织内MMP9含量及活性无明显差异。结论:持续电针预处理能够降低缺血再灌注后脑组织内MMP9的水平及活性。实验三、电针预处理对脑缺血再灌后血脑屏障TJP的影响目的:对血脑屏障TJP水平检测,证实电针预处理能够通过降低缺血后MMP9的表达使TJP水解程度减轻,发挥脑保护效应。方法:健康雄性SD大鼠30只,随机分为5组(n=6):Sham组、EA组、MCAO组、EA+MCAO组及MMP9抑制剂复合缺血再灌注组(BB1101+MCAO)。根据分组进行不同处理,其中BB1101+MCAO组于MCAO模型制作前30min腹腔注射BB1101(30mg/kg),再灌注48h后麻醉处死取半暗带组织。使用Western blot分别检测各组动物脑内三种紧密连接蛋白(Occludin、Claudin-5、ZO-1)的表达情况。结果:对三种紧密连接蛋白(Claudin-5、Occludin、ZO-1)分别检测后发现,与Sham组相比,MCAO组大鼠缺血半暗带的皮层及纹状体区三种蛋白表达明显下降(P<0.05);而与MCAO组相比,EA+MCAO组大鼠梗死侧大脑皮层及纹状体区的TJP水平则出现了显著升高(P<0.05);EA+MCAO组与BB-1101+MCAO组大鼠梗死侧脑内三种蛋白表达在皮层与纹状体区没有明显差异性,同时各组大鼠非梗死侧脑组织均未检测到这三种蛋白的明显变化。结论:电针预处理通过抑制脑缺血后MMP9的上调,减轻了TJP水解,发挥脑保护效应。实验四、电针预处理对缺血半暗带区炎症水平及NF-κB活性的影响目的:前三部分实验表明电针预处理能够通过抑制MMP9表达与活化,减轻TJP水解诱导脑缺血耐受,但其具体调控机制尚不清楚。本实验从检测电针预处理后脑缺血组织中的炎症水平及NF-κB核转位情况入手,探索电针预处理如何诱导缺血耐受,发挥神经保护作用。方法:健康雄性SD大鼠36只,随机分为4组:Sham组(n=6)、EA组(n=6)、MCAO组(n=12)及EA+MCAO组(n=12)。再将MCAO组及EA+MCAO组随机等分为两个批次,其中第一批次按分组进行电针预处理5d、缺血2h、再灌注48h后取材,使用ELISA法检测炎症因子(IL-1β、IL-10)及髓过氧化物酶(MPO)水平。另一批次与Sham及EA组合并,按分组要求预处理并在缺血2h、再灌注48h后取材,进行核-浆蛋白分离抽提后分别检测其NF-κB亚基p65的核转位情况。结果:①运用ELISA的方法检测不同分组大鼠脑组织中炎症因子表达水平及活性情况发现,与MCAO组相比,EA+MCAO组大鼠梗死侧脑组织皮层和纹状体的IL-1β水平明显降低(P<0.05)而IL-10水平则大幅升高(P<0.05),同时MPO活性显著降低(P<0.05)。但两组大鼠非梗死侧脑组织内IL-1β、IL-10水平及MPO活性无明显差异。②通过核-浆蛋白分离提取和Western blot对大鼠梗死侧脑组织不同脑区的核蛋白及浆蛋白进行检测。其中核蛋白检测结果显示,与Sham组相比,MCAO组大鼠缺血半暗带的皮层及纹状体区NF-κB亚基p65水平明显增高(P<0.05);与MCAO组相比,EA+MCAO组大鼠梗死侧脑组织皮层及纹状体区p65明显降低(P<0.05);浆蛋白检测结果则显示,与Sham组相比,MCAO组大鼠缺血半暗带的皮层及纹状体区p65水平明显降低(P<0.05);与MCAO组相比,EA+MCAO组大鼠梗死侧脑组织皮层及纹状体区p65水平则有所升高(P<0.05)。结论:电针预处理通过抑制NF-κB核转位减轻局部炎症反应而发挥脑保护作用。总结本研究发现持续电针预处理能够通过抑制MMP9的上调与活化,从而减轻TJP的降解,维持BBB完整性,诱导脑缺血耐受作用。另外还初步证明电针预处理的脑保护机制与其抑制NF-κB核转位减轻局部炎症反应密切相关。这提示电针预处理可成为临床减轻局部炎症反应,治疗缺血性脑卒中的手段。