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光对植物的生长发育有重要作用。光不仅为植物光合作用提供能量,也作为信号分子调控植物的生长发育。植物在进化过程中已形成一套由多个光受体组成的网络,用于接受外界光信号,使植物通过感受光的变化调整自身的生长发育。不同光受体感受光信号变化后,蛋白构象或定位发生改变,并通过与其相互作用的信号蛋白,把外界环境的光信号变化传递到体内下游信号转导途径中,从而影响着植物的生长发育,促使植物更好的适应外界环境。FHY3(FAR-RED ELONGATED HYPOCOTYL 3)及其同源蛋白FAR1(FAR-RED IMPAIRED RESPONSE 1)是光信号途径中重要的转录因子,可以直接结合下游靶基因启动子上的FBS(FHY3/FAR1 Binding Sites)顺式作用元件调控下游基因表达。已有研究报导,FHY3/FAR1参与了很多生物学过程的调控,例如ABA信号响应、生物钟调节、叶绿体分裂、氧化胁迫响应、淀粉合成等。DET1(DE-ETIOLATED 1)是光形态建成中的重要负调控因子,其功能缺失突变体det1-1在黑暗下表现出持续的去黄化表型。研究表明,DET1与COP10(CONSTITUTIVE PHOTOMORPHOGENIC 10)及DDB1(DAMAGED DNA BINDING PROTEIN 1)相互作用,形成CDD复合体。CDD复合体与支架蛋白CUL4形成CUL4-CDD复合体共同调控植物的光形态建成。为了研究光信号蛋白FHY3的调控机制,本研究以BD-FHY3为诱饵蛋白进行酵母双杂交cDNA文库筛选,发现FHY3与DET1存在蛋白相互作用。进一步通过染色质免疫沉淀及原生质体瞬时转化等技术,证明DET1参与调控了FHY3对下游基因的转录激活过程。最后,通过对FHY3和DET1突变体ABA敏感度表型的分析,证实了DET1可以抑制FHY3对下游靶基因的转录激活。结果如下所示:(1)通过酵母双杂交筛库发现FHY3与DET1蛋白存在相互作用,将FHY3与DET1分段构建酵母双杂交载体,并进行酵母双杂交实验,进一步验证了FHY3与DET1在酵母中相互作用。(2)用DET1与FHY3的转基因株系进行杂交,获得纯合株系后进行免疫共沉淀实验,结果表明FHY3和DET1在体内有相互作用。(3)在原生质体中共同表达DET1及FHY3蛋白,结果显示DET1不影响FHY3蛋白量。(4)染色质免疫沉淀实验表明DET1结合FHY3下游靶基因CCA1、ELF4及ABI5启动子区域的FBS顺式作用元件。(5)酵母转录激活实验及原生质体瞬时转化实验结果表明,FHY3可以激活下游靶基因CCA1,ELF4,ABI5的表达,而外源添加DET1则可以抑制FHY3对下游靶基因CCA1、ELF4及ABI5的激活。(6)在No-0生态型背景下的FHY3功能缺失突变体fhy3-4是ABA不敏感突变体,我们对Col-0生态型背景下FHY3突变体fhy3-11及DET1突变体det1-1的ABA敏感度进行分析,发现fhy3-11对ABA不敏感而det1-1对ABA敏感。进一步通过荧光定量PCR检测ABA信号响应相关基因的表达,我们发现det1-1对ABA的敏感可能是因为ABI5的过量表达所致。(7)通过对fhy3det1双突变体ABA敏感度的分析,发现FHY3的缺失可以部分恢复det1-1突变体的ABA敏感表型,表明det1-1突变体的ABA敏感表型部分依赖于FHY3对ABI5的激活。综上所述,我们发现DET1和FHY3相互作用,DET1抑制了FHY3对CCA1、ELF4及ABI5的激活,调控了植物生物钟的稳定性及对ABA信号响应的能力。