在过去的几十年中,基于酶催化功能的疗法,因其具有高度的专一性、良好的生物耐受性和较低的免疫毒性等优点,在生物医学中引起日益广泛的关注。其中,一些蛋白类的酶分子也表现出了优异的抗癌特性,已被尝试应用于癌症治疗。尽管这种基于蛋白酶催化的癌症治疗方法很有吸引力,但是由于酶分子本身具有稳定性差、易受环境影响发生降解和变性,以及低细胞透过率等局限性,严重制约了治疗性蛋白类酶分子在目标细胞内有效积累和功效发挥。因此,开发高效的蛋白类酶分子递送系统对于促进酶催化治疗的研究和应用至关重要。针对蛋白类酶分子在肿瘤细胞内的积累性差等问题。纳米反应器被尝试应用于蛋白酶的有效递送和活性调控。虽然,纳米反应器可以减少蛋白类的酶分子在血液循环中水解失活,并提高肿瘤部位的药物积累,但是,其复杂的制备过程和低负载率等缺点限制了其进一步的应用。亟需构建高负载率、高活性的基于蛋白酶的纳米反应器,从而实现其针对肿瘤细胞的有效递送,并阐明其细胞学命运和活性调控机理等。针对这些问题,本论文分别选取葡萄糖氧化酶（Glucose oxidase,GOx）、血红蛋白（Hemoglobin,Hb）和核糖核酸酶（Ribonuclease A,RNase A）作为治疗蛋白;选择沸石嘧啶框架（Zeolitic Pyrimidine Framework,ZPF）作为蛋白酶递送载体,构建纳米反应器,可有效解决材料合成复杂和蛋白酶负载效率低等问题。此外,本论文通过活细胞实时成像平台,对纳米反应器在亚细胞水平上的摄取、运输和胞内分布等过程进行了系统研究,揭示了纳米反应器进入细胞后沿微管运输至溶酶体处发挥酶催化作用的过程。通过对其杀伤肿瘤细胞的效应进行评估,证明该类纳米反应器可以发挥抑制癌细胞生长的作用。因此,本工作为蛋白酶的递送构建了一种更具潜力的平台,为酶催化治疗提供了一种新的思路。本论文主要包含以下三个方面的工作:1、基于葡萄糖氧化酶的纳米反应器的构建及应用葡萄糖氧化酶（GOx）作为一种潜在的抗癌药物,可以消耗葡萄糖（Glucose）和氧气（O2）生成葡萄糖酸和过氧化氢（H2O2）;GOx不仅阻断了细胞内的能量供应,而且所产生的H2O2在高浓度下可以促进癌细胞的死亡。本部分工作制备了基于葡萄糖氧化酶的纳米反应器（GOx@ZPF）,通过电镜、粒径检测和蛋白含量测定的结果可知,GOx@ZPF成功制备,通过对其催化活性进行检测,证明微酸环境能够提高GOx@ZPF的酶催化反应效率,增加H2O2的产量。细胞实验的结果表明,GOx@ZPF可有效地被细胞摄取,该纳米反应器最终分布于溶酶体处发挥催化作用,产生大量H2O2,导致细胞死亡。2、分离式纳米反应器在亚细胞水平上的应用与研究在复杂的生物体内,许多功能地实现需要多种酶发生级联反应共同完成。酶级联反应可以提高总体反应效率,成为调控细胞功能的重要手段。血红蛋白（Hb）是一种富含铁元素的蛋白质,其可以与H2O2发生芬顿反应（Fenton反应）,产生细胞毒性更强的活性氧-羟基自由基（·OH）。因此,GOx与Hb的组合可发生酶级联反应,达到增强癌细胞的杀伤效果。本部分工作构建一组分离式的纳米反应器（GOx@ZPF、Hb@ZPF）,透射电子显微镜（Transmission Electron Microscope,TEM）、场发射扫描电子显微镜（Field Emission Scanning Electron Microscope,FESEM）及动态光散射分析仪（Dynamic Light Scattering,DLS）表征证明分离式纳米反应器水合粒径均不大于250纳米,且分散性、稳定性良好。通过构建活细胞实时三色成像体系,对分离式纳米反应器在细胞内的运输过程及分布和组装过程进行了可视化探究。结果表明,GOx@ZPF与Hb@ZPF进入细胞后沿微管运输,并在运输的过程中进行组装,最终在溶酶体处发生酶级联反应,产生强毒性的·OH,从而增强癌细胞的杀伤效果。这种独特的分离式设计可大大降低纳米反应器在运输过程中对正常组织地损伤,为酶催化疗法提供了更加安全的方法和调控手段。3、响应型双酶纳米反应器的构建与应用本部分工作选择了核糖核酸酶（RNase A）作为治疗蛋白,它可以降解RNA诱导细胞凋亡。由于RNase A对于正常的组织和细胞具有较强的非特异性毒性,因此在给药前对它的活性进行可逆性地抑制是非常必要的。本部分工作选取4-硝基苯4（4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼硼酸-2-基）碳酸苄酯（4-nitrophenyl 4-（4,4,5,5-tetramethyl-1,3,2-dioxaborolan-2-yl）benzyl carbonate,NBC）与RNase A发生偶联反应,阻断蛋白酶活性;其产物RNase A-NBC（RNBC）可以响应活性氧（Reactive Oxygen Species,ROS）的刺激,在H2O2存在时发生裂解反应,重新释放RNase A,并恢复其活性。为了增强RNase A活性的恢复效率,将RNBC和GOx共同负载到ZPF中,形成响应型双酶纳米反应器。在以葡萄糖为主要营养源的癌细胞中,GOx可以不断产生H2O2,激活RNase A的活性,从而诱导细胞凋亡。本部分工作首先合成了NBC,并对RNase A进行修饰,生成RNBC,阻断其酶分子的活性。然后将RNBC与GOx共同装载入ZPF中,得到水合粒径约为245纳米,且分散性、稳定性良好的双酶纳米反应器。细胞学测试的结果表明,该纳米反应器能够有效地被肿瘤细胞摄取,并且因为GOx的存在,大大增强了癌细胞的杀伤效果。