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【目的】系统性红斑狼疮(SLE)是由于机体免疫耐受缺失而引起的自身免疫性疾病,通常伴随免疫复合物性肾小球肾炎,狼疮性肾炎(LN)是其主要并发症,严重影响患者预后。循环micro RNA(如血清micro RNA)在临床疾病诊断中发挥重要作用,可以作为潜在的诊断标记物。本文拟通过:1.microarray技术分析处于不同进展阶段的LN患者血清mi RNA的变化。2.探讨循环mi RNA对于LN的诊断价值及与LN临床参数相关性。3.从分子生物学机制探讨异常表达的循环mi RNA在LN发生发展中的作用。【方法】1.本研究一共囊括96份血清标本,60例LN患者和36名健康对照组。挑选出其中性别、年龄匹配的12份血清标本用于循环mi RNA表达谱筛选,包括早期LN患者4名(CKD分期1-3期),晚期LN患者4名(CKD分期4-5期)及健康体检者4名。使用mi RNA PCR芯片检测LN患者血清中372个mi RNA变化。2.剩余52名LN患者,包括40名早期LN患者、12名晚期LN患者及32名年龄、性别无差异的健康对照血清样本用于验证mi RNA表达谱筛选结果。200μL血清用于抽提总RNA,最后溶解于12μL无RNA酶水,Nanodrop 2000检测血清RNA抽提浓度;使用tagman茎-环引物探针real-time PCR检测差异循环mi RNA的相对表达量。分析循环mi RNA与LN患者临床参数相关性,受试者工作曲线(ROC)及曲线下面积(AUC)分析循环mi RNA对疾病诊断的价值。3.肾小管上皮细胞(HK-2)分别转染mi R-130b-3p mimics、inhibitor及各自相应的对照,并予以TGF-β1(10ng/ml)刺激。实时定量PCR和westen blot检测转染72h后细胞Ⅰ型胶原、Ⅳ型胶原、E钙连接素(E-cad)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)转录水平变化,westen blot检测E-cad、α-SMA蛋白水平变化;检测靶基因ERBB2IP及PPARγ的蛋白在转染mimics后水平变化。构建含有野生型ERBB2IP及PPARγ3’-UTR及突变的PPARγ3’-UTR双荧光素报告酶载体,分别予以对照mimic、突变mimic及正常mimic共转染,48h后检测荧光活性。【结果】1.与对照组相比,早期LN患者5个mi RNA表达下降倍数大于2,33个mi RNA上升倍数大于2。其中7个表达上升的mi RNA差异具有统计学意义;分别是:mi R-1233-3p(P=0.019),mi R-130b-3p(P=0.021),mi R-18a-3p(P=0.021),mi R-628-3p(P=0.023),mi R-1260b(P=0.030),mi R-1539(P=0.041)和mi R-378e(P=0.047),晚期LN组与健康对照组比较,共75个循环mi RNA表达下调大于2倍,其中P值小于0.05的mi RNA有21个;晚期LN组循环与早期LN组比较,共107个循环mi RNA表达下调,其中53个mi RNA其表达下调具有统计学意义(P<0.05)。对照组,早期LN患者、晚期LN患者RNA浓度依次为30.8(28.0,35.0)ng/μL、30.5(25.4,33.1)ng/μL、16.4(14.9,19.3)ng/μL,与对照组和早期LN组相比较,晚期LN患者血清总RNA浓度减少,其差异具有统计学意义(P<0.01)。2.早期LN组患者与对照组比较,血清中存在mi R-130b-3p升高[IQR 16.2(8.7,42.7)vs 9.6(4.8,17.4),p<0.01)],其差异具有统计学意义(P<0.01),循环mi R-130b-3p对于区分LN患者与正常对照均具有一定价值价值,ROC曲线下面积(AUC)=0.683±0.062(95%CI=0.561-0.805,P<0.01),最优敏感度和特异度分别为35.05%和96.8%;验证组显示早期LN患者血清mi R-1233-3p虽然高于健康对照组患者[IQR 10.4(6.4,16.9)vs 8.7(3.8,16.9)],但其统计学差异未见明显意义(P>0.05);相关性分析显示,循环mi R-130b-3p的相对表达量与LN患者疾病活动性各指标,如SLE疾病活动性评分(SLEDAI评分)、血清C3、C4、ds DNA、C反应蛋白(CRP)、红细胞沉降率(ESR)等无明显相关性(P>0.05),与24小时尿蛋白、慢性肾脏活动指数(CI)、甘油三酯(TG)呈正相关(P<0.05)。3.正常HK-2细胞在转染mi R-130b-3p mimic后,Ⅰ型胶原、Ⅳ型胶原、E钙连接素(E-cad)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达并没有显著差异;但在TGF-β1刺激时,mi R-130b-3p的转染可以增加小管上皮细胞Ⅰ型胶原、Ⅳ型胶原、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的m RNA和蛋白表达水平,并下调E-cad的表达,差异具有统计学意义(P<0.05);相反的作用见于转染mi R-130b-3p inhibitor;转染mi R-130b-3p mimics无论伴或者不伴有TGF-β1(10ng/ml)刺激的情况下,与对照组相比,mi R-130b-3p mimics可以显著下调PPAR-γ或者ERBB2IP蛋白表达水平(P<0.05);mi R-130b-3p mimics与构建ERBB2IP基因的3’UTR及突变的荧光素酶报告质粒共转染工具细胞293T细胞后,与NC和mut-mi R-130b-3p组相比,wt-mi R-130b-3p mimics与质粒共转染使海肾荧光素酶活性下降,海肾荧光素酶与萤火虫荧光素酶活性之比下降(P<0.01),而NC-mimics及mut-mi R-130b-3p对质粒的作用无显著性差异(P>0.05);mi R-130b-3p mimics使wt-PPAR-γ-3’-UTR海肾荧光素酶与萤火虫荧光素酶活性之比下降(P<0.01),NC mimic及mut-PPAR-γ无此作用。【结论】LN肾炎患者存在血清mi RNA表达异常;对于严重肾功能受损患者,循环mi RNA存在整体下降;早期升高的循环mi R-130b-3p可能通过与PPAR-γ和ERBB2IP 3’-UTR直接结合而调控肾小管上皮细胞EMT作用,参与早期LN肾脏损害。