脑创伤的发病率逐年升高,如何降低致死率和致残率就显得尤为重要。TBI引起的一系列生化生理和病理方面反应可以导致神经元持续数天到数周时间的细胞死亡和神经功能障碍。以前在TBI引发的神经功能障碍与细胞坏死和凋亡方面研究较为深入。自噬作为神经细胞死亡的一种形式,近期越来越受到关注,但是在TBI中的作用机制研究不足。目前国内外研究焦点集中于创伤后的神经元自噬过程中信号转导通路和标志性基因方面。细胞内外的很多刺激可以诱导自噬的激活,其是一系列细胞分子事件的级联反应的结果。近来研究发现MAPK家族的JNK基因在神经元自噬发生后表达升高,同时其下游因子p53同时表达也升高,这是否与外伤导致神经元自噬的激活有关,目前不得而知。文献报道在研究肺癌肿瘤细胞的自噬之中发现,自噬基因DRAM是p53的靶基因,对于癌细胞的自噬存在调节作用,同时p53对于自噬标志基因beclin-1与bcl-2/bcl-xl复合体的解聚存在调节作用。说明肿瘤抑制因子p53在肺癌中可以调控自噬。我们前期的实验提示在TBI后存在自噬的激活,自噬标志因子LC3、 beclin-1表达升高。那么JNK通路是否能通过对p53的调节来激活神经元自噬,在TBI中是这条通路是否成立这也是本研究的目的,本论文分三部分来阐述。第一部分大鼠弥漫性脑创伤后自噬相关蛋白的表达目的：本部分研究应用雄性SD大鼠复制Marmarou闭合性弥漫性颅脑创伤模型,检测大鼠弥漫性脑创伤后是否存在神经元自噬。方法：采用本实验室改良Marmarou方法。大鼠随机分成：①假手术组(n=48),②脑创伤组(n=48),取伤后1h、6h,12h、24h、48h、72h6个时间点。检测①HE染色；②免疫组学法检测beclin-1的蛋白表达；③Western-blot法检测LC3II/LC3I的比值和beclin-1的蛋白表。应用Image Proplus6.0和Gel-Doc分析系统定量分析测定。实验中所得数据均用x±s表示,用SPSS11.5统计软件进行重复方差分析,以单侧P<0.05,表示差异有统计学意义。结果：1光镜下观察大鼠脑创伤模型切片1.1伤后大鼠脑组织大体观察伤后可见蛛网膜下腔出血,伴随少量脑室出血；点状出血于脑实质多见,多低位脑干的背侧,脑表面的血管充血明显,未见局部脑挫伤。1.2HE染色观察组织形态学的改变Sham组脑组织结构正常,血管管腔正常,管壁光滑,神经细胞数量多,形态完整；TBI组神经元胞体皱缩呈三角形,胞浆嗜色性染色减弱,核仁皱缩浓染,细胞周围出现间隙,出现神经元细胞变性坏死改变。2海马和皮层部位beclin-1免疫组化检测结果beclin-1定位于神经元细胞的胞质,Sham组偶见阳性细胞,着色浅淡,免疫反应性不随时间发生变化。TBI组与sham组比较,伤后6h beclin-1阳性细胞显著增多,着色加深,免疫反应性增强(P<0.05),伤后48h达高峰(P<0.05),72h开始下降(P<0.05),TBI组24h和72h的结果与48h结果比较差异有统计学意义(P<0.05)。3海马和皮层部位LC3的Western blot检测结果Sham组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值和LC3Ⅰ与LC3Ⅱ的蛋白表达量在各时间点无变化；TBI组LC3Ⅱ和LC3II/LC3I的比值随着时间点依次升高,TBI组与Sham组比较,伤后6h开始LC3II/LC3I的比值显著升高(P<0.05),伤后表达持续升高,高表达状态持续至伤后72h(P<0.05)。4海马和皮层部位beclin-1的Western blot检测结果Sham组beclin-1蛋白表达量在各时间点无变化；TBI组与Sham组比较,伤后6h beclin-1蛋白量显著增高(P<0.05),伤后48h达高峰,高表达状态持续至伤后72h(P<0.05),伤后72h开始下降(P<0.05)；TBI组24h和72h的结果与48h结果比较差异有统计学意义(P<0.05)。5LC3和PI的共聚焦检测结果在TBI组中神经元细胞胞浆中可见大量绿色和红色荧光聚集,此时细胞核和胞浆清晰可见；TBI组伤后12h中LC3在神经元细胞胞浆中阳性细胞数量明显增多,阳性强度增强,此时细胞核仁清晰。小结：改良的Marmarou弥漫性脑创伤模型满足了本实验对神经元自噬的研究；大鼠脑创伤后,beclin-1和LC3持续升高证明存在神经元自噬。第二部分JNK介导p53通路在TBI中对大鼠海马神经元自噬的影响目的：本部分实验通过应用JNK抑制剂SP600125,检测INK、p-p53、 DRAM和beclin-1的表达来证明JNK介导p53通路在TBI中调控大鼠海马神经元自噬是否成立。方法：大鼠模型同上,将296只成年雄性SD大鼠随机分成4组：①假手术组(n=74),②脑创伤组(n=74)③DMSO组(n=74)④抑制剂组(n=74)。术后时间点同上。取80只大鼠行水迷宫测试,每组划分为伤后7d、8d、9d及10d四个时间点。检测①HE染色；②免疫组化法和共聚焦法检测p53、 beclin-1和DRAM的蛋白表达定位情况；③Western-blot法检测JNK. p53. beclin-1和DRAM的蛋白表达量。定量分析和统计同上结果：1HE染色组织形态学改变光镜下伤后24h可见Sham组和TBI组脑组织结构同前TBI+SP600125组病理形态改变较TBI组有不同程度减轻,可见神经元数量多,排列整齐,形态完整,核质均匀,核仁清晰；TBI+DMSO组与TBI组比较变化不大。2JNK的Western blot检测结果Sham组JNK蛋白表达量在各时间点无变化；TBI组与Sham组比较,伤后1h JNK蛋白量显著增高(P<0.05),伤后12h达高峰,高表达状态持续至伤后24h(P<0.05),伤后24h开始下降(P<0.05); TBI组与TBI+DMSO组比较有差异无统计学意义(P>0.05);TBI+SP600125组JNK蛋白表达时程与TBI组相似,但表达量减少,与TBI组比较,以伤后6h、12h和24h差异有统计学意义(P<0.05)。3p-P53和DRAM的Western blot检测结果Sham组p-p53和DRAM蛋白表达量在各时间点无变化；TBI组与Sham组比较,伤后1h p-P53蛋白量显著增高(P<0.05),伤后24h达高峰,高表达状态持续至伤后48h(P<0.05),伤后48h开始下降(P<0.05)；TBI组与TBI+DMSO组比较有差异无统计学意义(P>0.05); TBI+SP600125组p-p53和DRAM蛋白表达时程与TBI组相似,但表达量减少,与TBI组比较,以伤后12h、24h、48h和72h差异有统计学意义(P<0.05)。4Beclin-1的Western blot检测结果Sham组beclin-1蛋白表达量在各时间点无变化；TBI组与Sham组比较,伤后1h beclin-1蛋白量显著增高(P<0.05),伤后48h达高峰,高表达状态持续至伤后48h(P<0.05),伤后72h开始下降(P<0.05); TBI组与TBI+DMSO组比较有差异无统计学意义(P>0.05); TBI+SP600125组beclin-1蛋白表达时程与TBI组相似,但表达量减少,与TBI组比较,以伤后6h、12h、24h、48h和72h差异有统计学意义(P<0.05)。5DRAM和beclin-1免疫组化检测结果光镜下DRAM和beclin-1标记为棕黄色颗粒,定位于胞浆。Sham组偶见阳性细胞,着色浅淡,免疫反应的数量和强度不随时间点发生变化。TBI组与Sham组比较,伤后6h DRAM和beclin-1阳性细胞显著增多,着色加深,免疫反应性增强(P<0.05),伤后分别于24h和48h达高峰(P<0.05); TBI组与TBI+DMSO组比较有差异无统计学意义(P>0.05); TBI+SP600125组DRAM和beclin-1免疫阳性反应性时间点与TBI组相似,但是免疫反应性减弱,以12h、24h、48h和72h,差异有统计学意义(P<0.05)。6p-P53与DRAM和beclin-1的激光共聚焦检测结果p-P53阳性细胞胞浆为FITC标记的绿色荧光,DRAM和beclin-1阳性细胞胞浆为TRITC标记的红色荧光。TBI组可见p-p53与DRAM和beclin-1在神经元细胞胞浆中可见大量绿色和红色荧光聚集,此时细胞核清晰可见；TBI+SP600125组中p-p53与DRAM和beclin-1在神经元细胞胞浆中阳性细胞数量明显减少,阳性强度减弱,此时细胞核仁清晰度降低。7神经功能评分结果Sham组评分为24分；TBI组评分7-9分；TBI+SP600125组评分15-18分。与sham组比较,在TBI组和TBI+SP600125组中,大鼠在后肢抓持反射、触须诱发前肢定位及侧向垫步试验中均表现异常,评分下降,差异有统计学意义(P＜0.05); TBI+SP600125组与TBI组比较,评分明显提高(P<0.05)。8Morris水迷宫结果TBI组和TBI+DMSO组伤后第9天及第10天搜索安全岛潜伏期较sham组明显延长,存在差异有统计学意义(P<0.05)。TBI+SP600125组伤后第9天及第10天搜索安全岛潜伏期较TBI组明显缩短存在差异有统计学意义(P<0.05)。小结：大鼠弥漫性脑创伤后JNK通路激活引起p53磷酸化,自噬基因DRAM和beclin-1的表达升高；p-p53对DRAM有显著的调控作用；脑创伤前给予JNK抑制剂SP600125可以降低继发性神经损伤,具有神经保护的作用,改善了脑创伤后大鼠学习和记忆功能。第三部分大鼠弥漫性脑创伤后p53的表达对beclin-1和bcl-2的调控机制研究目的：本实验应用p53抑制剂PFT-α通过应用激光共聚焦、免疫印迹和免疫共沉淀的检测方法来检测p-p53、 p-bcl-2、 bcl-2、bcl-xl和beclin-1的表达来验证是否脑创伤后p53变化调控复合物解离。方法：将240只成年雄性SD大鼠随机分成4组：①假手术组(n=60),②脑创伤组(n=60)③DMSO组(n=60)④抑制剂组(n=60)。每组又分别划分为伤后6h、12h、24h、48h等4个时间点。水迷宫测试同上部分。检测①激光共聚焦方法检测beclin-1与bcl-2和p53的蛋白表达定位情况③IP和Western-blot法检测beclin-1、 bcl-2、 bcl-xl、 p-bcl-2和p-p53的蛋白表达量。分析和统计同前。结果：1p-bcl-2和p-p53的Western blot检测结果TBI组和TBI+DMSO组各个时间点与Sham组比较,伤后6h p-bcl-2和p-p53蛋白量显著增高(P<0.05),伤后24h达高峰,伤后48h表达量下降(P<0.05); TBI+PFT-α组与Sham组比较p-bcl-2和p-p53蛋白表达量逐渐减弱,以伤后6h、12h和24h差异有统计学意义(P<0.05)。2IP及Western blot法检测TBI组和TBI+DMSO组的beclin-1、 bcl-xl和bcl-2的结果Beclin-1的表达在TBI组和TBI+DMSO组各个时间点与Sham组比较,伤后由12h开始beclin-1蛋白量显著降低(P<0.05); Bcl-xl和bcl-2的表达在TBI组和TBI+DMSO组各个时间点与Sham组比较,伤后由6h开始bcl-xl和bcl-2蛋白量显著降低(P<0.05)；同时实验发现伤后12h、24h和48h bcl-2蛋白量变化较bcl-xl蛋白量变化幅度更大,有统计学差异(P<0.05)。3IP及Western blot法检测TBI+PFT-a组的beclin-1.bcl-xl和bcl-2的结果Beclin-1的表达在TBI+PFT-α组各个时间点与Sham组比较,伤后由48h开始beclin-1蛋白量降低有统计学意义(P<0.05)；Bcl-xl和bcl-2的表达在TBI+PFT-a组各个时间点与Sham组比较,伤后由48h开始bcl-xl和bcl-2蛋白量降低统计学意义(P<0.05)；同时实验发现伤后48h bcl-2蛋白量变化较bcl-xl蛋白量变化幅度更大,有统计学差异(P<0.05)。4Beclin-1与bcl-2和p-p53的激光共聚焦检测结果Bcl-2和p-p53阳性细胞胞浆为FITC标记的绿色荧光,beclin-1阳性细胞胞浆为TRITC标记的红色荧光。TBI组可见beclin-1与bcl-2和p-p53在神经元胞浆中可见大量绿色和红色荧光聚集,此时细胞核清晰可见；TBI+PFT-α组中beclin-1与bcl-2和p-p53在神经元胞浆中阳性细胞数量明显减少,阳性强度减弱,此时细胞核仁清晰度降低。5神经功能评分结果Sham组评分为24分；TBI组评分在7-10分之间；TBI+PFT-α组评分16-20分之间。与TBI组比较在TBI+PFT-a组中,大鼠在后肢抓持反射、触须诱发前肢定位及侧向垫步试验中表现均明显改善,评分明显提高,差异有统计学意义(P<0.05)6Morris水迷宫结果TBI组和TBI+DMSO组伤后第9天及第10天搜索安全岛潜伏期较sham组明显延长,存在差异有统计学意义(P<0.05)。TBI+PFT-α组伤后第9天及第10天搜索安全岛潜伏期较TBI组明显缩短存在差异有统计学意义(P<0.05).小结：大鼠弥漫性脑创伤后beclin-1-bcl-2/bcl-xl复合物解离,导致神经元自噬水平升高；p53调控beclin-1-bcl-2/bcl-xl复合物解离,间接影响脑创伤后神经元自噬；脑创伤前给予p53抑制剂PFT-a可以降低继发性神经损伤,具有神经保护的作用,改善了脑创伤后大鼠学习和记忆功能。结论：在大鼠弥漫性脑创伤中,JNK通路可以通过介导p53的磷酸化调控自噬因子DRAM、 beclin-1的表达,达到调控神经元自噬的目的,同时阻断JNK的传导通路可以有效的抑制脑创伤后神经元的自噬,具有神经保护作用,改善了脑创伤后大鼠学习和记忆功能。