论文部分内容阅读
目的:探讨富含谷氨酸SH3结构域类蛋白1（SH3 domain binding glutamate rich protein like 1,SH3BGRL1）基因在宫颈癌细胞和组织中蛋白质与m RNA的表达、SH3BGRL1基因与HPV（Human Papilloma Virus）感染之间的关系;研究SH3BGRL1基因对宫颈癌细胞的增殖、迁移和细胞周期的影响,探讨SH3BGRL1基因通过Src-Akt-Erk信号通路抑制宫颈癌细胞的增殖和迁移能力。方法:（1）通过The Human Protein Atlas（HPA）、UALCAN和Gene Expression Profiling Interactive Analysis（GEPIA）等数据库分析SH3BGRL1在正常宫颈组织和宫颈癌组织中的表达。（2）利用芯片捕获测序方法（Chip capture sequencing）分析HPV16病毒整合在SH3BGRL1基因的部位。（3）利用正常宫颈组织和宫颈癌组织构建组织芯片,并运用免疫组织化学染色（Immunohistochemical staining,IHC）分析SH3BGRL1在组织中的表达情况。（4）将收集的宫颈组织样本运用第二代杂交捕获技术（HC-2）分析该基因与HPV感染的关系。（5）采用Western blot和q RT-PCR技术检测SH3BGRL1基因在癌细胞的蛋白质及m RNA的表达水平。（6）分别设计和构建SH3BGRL1基因的过表达质粒和RNA干扰质粒并转染He La和Si Ha两种宫颈癌细胞,对照组（NC）为细胞转染空质粒。（7）MTT比色法、平板克隆实验检测过表达SH3BGRL1基因后,He La和Si Ha两种宫颈癌细胞的增殖能力;同样运用MTT比色法和平板克隆实验检测转染RNA干扰质粒后,He La和Si Ha的增殖情况。（8）Transwell实验和划痕实验检测SH3BGRL1基因过表达后,He La和Si Ha细胞的迁移能力;运用Transwell实验检测RNA干扰SH3BGRL1基因后,He La和Si Ha宫颈癌细胞的迁移情况。（9）流式细胞术检测过表达SH3BGRL1基因对宫颈癌He La和Si Ha细胞周期的影响。（10）Western blot检测过表达SH3BGRL1基因后,周期蛋白依赖性蛋白激酶4（cyclin-dependent kinase 4,CDK4）和周期蛋白依赖性蛋白激酶6（cyclin-dependent kinase 6,CDK6）等细胞周期相关分子的蛋白质表达水平。（11）Western blot检测增殖和迁移相关的信号通路中主要分子（Src、Akt、Erk）的总蛋白质及其磷酸化蛋白质的表达量。结果:（1）HPA数据库分析,SH3BGRL1基因在宫颈正常组织较高表达,UALCAN和GEPIA数据库分析显示SH3BGRL1基因在正常宫颈组织中高表达,宫颈癌组织中低表达（P＜0.05）。（2）芯片捕获测序方法分析这些整合位点都在该基因的内含子处,而且远离外显子,表明可能对该基因表达无影响。通过进一步分析可知,HPV16病毒整合该基因的可能原因是由于微同源重组所致。（3）免疫组织化学染色结果显示,宫颈癌组织中SH3BGRL1低表达,正常宫颈组织高表达（P＜0.05）。（4）HC-2分析结果表明SH3BGRL1基因的表达可能不受HPV感染的影响（P＞0.05）。（5）Western blot和q RT-PCR实验结果表明,与Ha Ca T细胞（永生化角质形成细胞的一种）相比,三种宫颈癌细胞（Si Ha、He La、C33A）中SH3BGRL1蛋白质和m RNA的表达量显著降低（P＜0.05）。（6）MTT比色法及平板克隆实验结果显示,当过表达SH3BGRL1基因后,宫颈癌细胞Si Ha和He La的增殖能力受到抑制（P＜0.05）;当RNA干扰SH3BGRL1基因后,则促进了宫颈癌细胞Si Ha和He La的增殖能力（P＜0.05）。（7）Transwell和划痕实验结果显示,过表达SH3BGRL1基因抑制了Si Ha和He La细胞的迁移能力（P＜0.05）;反之,在Transwell实验中,RNA干扰SH3BGRL1基因后促进了宫颈癌细胞的迁移（P＜0.05）。（8）流式细胞术和Western blot结果显示,过表达SH3BGRL1基因后,宫颈癌He La和Si Ha细胞周期阻滞在G0/G1期,而G2/M期显著减少且S期无明显变化,从而抑制细胞的增殖水平（P＜0.05）;细胞周期相关分子CDK4和CDK6表达量降低,差异具有统计学意义（P＜0.05）。（9）Western blot实验结果显示,SH3BGRL1基因显著抑制了Src-Akt-Erk通路中Akt、Erk的磷酸化及其上游分子Src的磷酸化,差异具有统计学意义（P＜0.05）。结论:SH3BGRL1基因在宫颈癌组织和细胞中低表达,且表达与HPV感染无相关性。SH3BGRL1基因的过表达可能通过Src-Akt-Erk信号通路抑制宫颈癌细胞的增殖和迁移。