论文部分内容阅读
为建立一套系统的斑点叉尾鮰伪雌鱼培育技术,本实验首先为建立一种准确和快速的斑点叉尾鮰遗传性别鉴定方法,其次研究不同浓度17β-雌二醇（17β-estradiol,17β-E2）和温度处理下对斑点叉尾鮰开口仔鱼连续饲喂27 d进行雌性性别诱导,探究斑点叉尾鮰XY雄鱼雌性化的合适17β-E2剂量和养殖温度。最后,为进一步探究温度诱导斑点叉尾鮰雌性化的性别控制机制,根据全基因组甲基化测序和转录组测序的方法分析基因的甲基化水平差异及基因在转录组中的表达情况,进一步探究基因在性别控制中的作用。1.根据性别连锁SNP（Single nucleotide polymorphism）位点,设计外围引物、SNP特异性延伸引物和DNA探针。性别连锁SNP特异性引物延伸反应结束后,将扩增终产物与DNA探针杂交,并应用基于免疫胶体金技术的核酸检测试纸检测性别连锁SNP,从而实现遗传性别分子水平的可视化鉴定。结果显示,本试验中开发的斑点叉尾鮰遗传性别鉴定方法能够准确地鉴定斑点叉尾鮰的遗传性别,与基于性别连锁微卫星标记的遗传性别鉴定方法所得结果一致。本研究表明,斑点叉尾鮰性别连锁SNP特异性引物延伸反应联合基于免疫胶体金技术的核酸试纸能够准确、快速地完成的遗传性别鉴定。2.在探究斑点叉尾鮰XY雌鱼培育方法过程中,研究中激素诱导组以卤虫-人工配合饲料为17β-雌二醇（17β-estradiol,17β-E2）载体,对斑点叉尾鮰开口仔鱼连续饲喂27 d进行雌性性别诱导,探究斑点叉尾鮰XY雄鱼雌性化的合适17β-E2剂量。60日龄测量并统计各组试验鱼的生长数据、存活率,解剖观察性腺结构,结合遗传性别鉴定结果计算性逆转率,并通过组织切片分析各组试验鱼中XX和XY雌鱼卵巢发育情况。270日龄检测XY雌鱼和对照组雌鱼的鳃、心脏、肝脏、肾脏、卵巢、肌肉等组织中17β-E2含量。研究进一步地采用q RT-PCR检测17β-E2诱导组中270日龄雌雄性别分化基因foxl2和dmrt1以及dmrt2b、dmrt5、dmrt6在XX和XY雌鱼卵巢中的表达水平,同时采用q RT-PCR检测gsdf基因在60日龄和一年半XY雌鱼,XX雌鱼和XY雄鱼的性腺中表达情况,采用寡核苷酸探针m RNA原位杂交的方法对一年半龄斑点叉尾鮰的精巢、卵巢以及XY雌鱼的卵巢中gsdf基因的表达进行分析。结果显示:在17β-E2诱导组中,各组XY雌鱼的比例和卵母细胞数量均随17β-E2剂量的提高而增多,且核仁数量也随之增多,而核质比相应减小;各组XY雌鱼的体重和体长随着17β-E2剂量的提高先增加后减小,但存活率没有显著性变化;各组XY雌鱼与对照组雌鱼的鳃、心脏、肝脏、肾脏、肌肉组织中17β-E2含量均无显著性差异,卵巢中17β-E2含量与添加剂量呈正相关;雌性性别分化基因foxl2在XY雌鱼中的表达量显著升高,雄性性别分化基因dmrt1在XY雌鱼中的表达量显著降低。与XX雌鱼相比,XY雌鱼卵巢中dmrt2b和dmrt5表达显著上调（P＜0.05）,dmrt1和dmrt6表达显著下调（P＜0.05）。提示这些dmrt基因家族成员可能在XY雌鱼的性逆转过程中发挥重要作用。gsdf基因在一年半龄的XY雄鱼中的表达量与其它组织呈极显著性差异（P＜0.01）,但是gsdf基因在60日龄和一年半龄的XX雌鱼和XY雌鱼中的表达量无显著性差异（P＞0.05）。gsdf基因m RNA在精巢的支持细胞中表达,但是在正常雌鱼的卵巢中未见表达,在XY雌鱼的卵巢中仅有极少量表达。表明gsdf基因主要参与精巢的维持作用。3.本研究在性别分化前以温度诱导斑点叉尾鮰雌性化的方法,探究雄性斑点叉尾鮰雌性化的合适水体温度。在试验鱼60日龄时,测量并统计各组试验鱼的生长数据、存活率、卵巢形成比例,同时结合遗传性别鉴定结果计算各组的性逆转率。分别在解剖学和组织学水平观察各组试验鱼的性腺结构和卵母细胞发育水平。研究进一步对正常雌鱼和温度诱导的XY雌鱼进行全基因组甲基化测序,通过分析各样本的甲基化类型,甲基化水平,分析差异甲基化水平的基因,对该差异基因进行转录组中表达量分析,同时对性别相关基因进行转录组表达量分析。结果显示:提高温度能显著提高试验鱼的性逆转比例,随着温度的升高,XY雌鱼卵巢中卵母细胞的发育加快,体长、体重先增加后减小,存活率逐渐降低;对正常雌鱼和温度诱导后的XY雌鱼进行全基因组甲基化测序发现,温度诱导的XY雌鱼的甲基化水平高于正常雌鱼,且CG型甲基化水平远高于CHH型和CHG型。在对锚定的转录启动子区域进行差异基因分析时发现类固醇激素生物合成通路信号通路富集差异基因,XY雌鱼的雌性性别相关基因在转录组中的表达被激活,雄性相关基因被抑制,XY雌鱼和正常雌鱼性别相关基因在转录组中的表达量无显著差异。研究探究了温度诱导斑点叉尾鮰雌性化的方法,为深入研究温度诱导斑点叉尾鮰雌性化机制提供理论支持,为建立环境友好型的斑点叉尾鮰性别控制育种模式提供前期探索。该论文共图17幅,表12个,参考文献128篇。