论文部分内容阅读
OX40(CD134)是分子量为50kD的Ⅰ型跨膜糖蛋白，属TNFR超家族成员，主要表达于活化的CD4~+T细胞表面，CD8~+T表面也有少量表达，如ConA和PHA激活的CD4~+和CD8~+T细胞，人、鼠炎症部位的CD4~+T细胞，成人T细胞白血病(ATL)细胞，人HTLV-1病毒感染的建株T细胞HuT102和MT-2。编码人OX40的基因位于1p36，长约1.4kb，编码277个氨基酸。其配体OX40L(CD134L)为TNF超家族成员，分子量为34～40kD的Ⅱ型跨膜糖蛋白。人OX40L主要表达于成熟的树突状细胞(DC)、活化的B细胞、血管内皮细胞(VEC)、脐带静脉血管内皮细胞(HUVEC)、巨噬细胞以及某些组织器官包括心、骨骼肌、睾丸和肺等。OX40／OX40L介导的共刺激信号，参与了T细胞的活化、增殖和迁移，维持T细胞的长期生成，以及协同CD28信号促进生发中心的形成。CD28／B7主要在初次免疫应答中起作用，而OX40／OX40L信号在初次免疫的后期，二次免疫应答及免疫记忆中发挥重要的调节效应。同时OX40L还能介导逆向共刺激信号，协同CD40信号诱导DC进一步分化成熟；在内皮细胞上，OX40L逆向信号能上调表达趋化因子RANTES／CCL5。由于OX40主要表达在炎症部位的抗原特异性T细胞上，使其成为一个理想的免疫干预的靶分子，有望通过在体内阻断OX40／OX40L的相互作用或消除OX40~+T细胞来减弱自身免疫性疾病及移植排斥反应，而应用激发型抗OX40的单抗来增强OX40信号、促进细胞因子的分泌和增加抗原特异性记忆细胞的数量，从而提高机体抗肿瘤的能力。 1．人OX40 cDNA的克隆及转基因细胞的构建。本研究通过RT-PCR方法，从PHA活化的扁桃体T细胞的总RNA中扩增获得编码人OX40的cDNA片段，通过基因克隆技术，将其插入真核表达载体pcDNA3.1。进一步通过脂质体转染技术将此重组表达载体导入小鼠成纤维细胞L929中，G418抗性筛选获得能稳定表达人OX40转基因细胞及鼠抗人OX40激发型单克隆抗体的研制摘要OX40的转基因细胞L929一OX40。经体外长期传代和液氮反复冻存复苏，转基因细胞生长良好，0X40的表达稳定在80%以上。2.L929一OX40转基因细胞对DC的促分化作用。据文献报道，OX40L能介导逆向共刺激信号，促进DC的分化成熟。因此利用上述构建的转基因细胞初步探讨了转基因细胞对DC的刺激作用。按照本科室建立的DC诱导方案，将新鲜分离获得的人外周血单个核细胞(PBMC)在GM一CSF和几一条件下培养6d后，添加可溶性CD40L(sCD40L)并与L929一0X40共育，48h后，流式细胞术检测到CD40、CD86、CD83进一步上调表达。3.鼠抗人0x40杂交瘤细胞株的研制。利用上述构建的转基因细胞L929.OX40为免疫原，免疫BALB/c小鼠，采用B淋巴细胞融合技术，将免疫后小鼠的脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞SPZ/0进行细胞融合，以此转基因细胞以及PHA活化的T细胞作为阳性筛选细胞，以转空质粒的对照细胞L929一Mock作为阴性对照细胞，经免疫荧光标记分析及抗体分泌阳性孔内细胞的反复筛选，并经多次克隆化培养，最终获得2株持续、稳定分泌鼠抗人ox40单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为7Ell和5HI。经快速定性试纸法分析鉴定，7Ell的Ig类别为IgGZb，而5HI则为IgM。经体外连续传代(4。代)培养，液氮冻存半年后复苏，仍生长良好，稳定分泌抗体。4.单抗7En的生产和纯化。采用本室建立的小鼠体内诱生腹水方案诱生腹水，腹水形成的阳性率为95%，腹水的产量平均为6mU只小鼠。腹水的纯化通过ProteinG亲和层析法实现。腹水型单抗经纯化后，单抗蛋白含量在0.8~1.2mg/ml之间。经免疫荧光标记分析表明，腹水型单抗的效价为1:10万以上，纯化后抗体蛋白用于间接免疫荧光标记的用量为1.0-2.0，创5XI护细胞。5.单抗7En识别位点研究。通过与BD PharMingen公司鼠抗人Ox40-FITC单抗(克隆号ACT35)的竞争抑制试验，单抗7Ell完全不能阻断OX4压F仃C单抗与相应抗原的结合，提示该单抗与上述商品化的单抗识别不同的抗原位点。6.单抗7En对活化的T细胞促增殖作用及细胞因子分泌的影响。取正常人新鲜外周血，通过常规的Ficoll密度梯度分离法，获得PBMC，再通过绵羊红细胞E花环形成试验，获得纯度较高的T细胞(CD3阳性率90%以上)。经过激发型鼠抗人子OX40转荃因细胞及鼠抗人OX40橄发型单克隆抗体的研制摘要CD3和CD28单抗刺檄1~2d后，加入7Ell单抗继续培养，发现该单抗能够明显促进活化的T细胞进一步增殖(2~3倍)，上调表达IL一2和IFN一Y，下调IL-10。因此单抗7Ell属于激发型的单克隆抗体，对体外扩增活化的T细胞具有很明显的作用，并且能促使T细胞向Thl方向分化，在肿瘤免疫治疗中具有潜在的临床应用价值，值得进一步深入研究。 综上所述，本研究成功克隆了编码人OX40分子的cDNA片断，构建了能稳定表达人OX4O分子的转基因细胞，初步探讨了该转基因细胞对DC的促分化作用，证明了表达在DC表面的OX4OL分子能介导逆向共刺激信号:成功研制出能稳定和特异分泌抗人OX40激发型单克隆抗体的杂交瘤细胞株，初步探讨了该单抗对活化T细胞的刺激作用，证明该单抗在体外可进一步扩增活化的T细胞，这可能是通过上调表达IL一2而起作用。并且该单抗能促进T细胞上调表达IFN一Y，下调表达