小麦抗逆基因TaSAP家族成员优异单倍型发掘

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小麦(Triticum aestivum L.)是世界的三大主要粮食作物之一,干旱、盐渍等是制约小麦生产的主要逆境条件。发掘小麦的抗逆基因资源,改良品种的抗逆性是应对环境胁迫的重要途径。分离和鉴定在小麦种质中蕴藏的丰富等位变异不仅可以从分子角度研究抗逆机理,而且可以利用优异等位变异开发出功能标记,在分子标记辅助育种中起到积极的作用。植物SAP(stress-associated protein)基因家族主要参与逆境响应。本研究以小麦TaSAP基因家族为研究对象,根据其表达模式与聚类分析筛选显著响应逆境的家族成员进行标记开发与关联分析,发掘TaSAP基因家族中的重要基因及其优异等位基因,解析其作用机理,为小麦分子育种提供基因资源;利用拟南芥和水稻作为受体进行转基因,验证目的基因的功能。通过酵母双杂筛选与目的基因互作的蛋白,初步揭示了TaSAPs基因的作用机理。主要研究结果如下:1、以小麦基因组测序数据为基础,运用隐马尔科夫模型工具(HMMER)筛选出小麦TaSAP家族基因序列23个。2、获得的23个TaSAP基因均能被各类逆境胁迫诱导,但呈现不同的表达模式。根据逆境下基因的表达模式挑选出6个显著响应不同胁迫的基因成员;亚细胞定位表明TaSAP2初步定位在叶绿体中,TaSAP5与TaSAP7在细胞核、质、膜中都有表达,TaSAP3与TaSAP18在核、质、膜中均有表达,并在细胞核中强烈表达;缺四体定位表明,TaSAP2定位在第六同源群上,TaSAP3和TaSAP5定位在第五同源群上,TaSAP6定位在第二同源群上,TaSAP7定位在第七同源群上。结合文献报道的相关物种多个成员序列的聚类分析,挑选出TaSAP3作为关联分析的目标基因。3、以小麦的多态性群体为材料,检测TaSAP3的序列,在3.1 kb的序列中检测出12个SNP位点和31个InDel位点,根据-647bp处的一个InDel位点和-784bp处的一个SNP位点开发分子标记,分别命名为TaSAP3.647和TaSAP3-784;利用这两个标记将包括262份材料的自然群体划分为3种单倍型;利用TaSAP3-647将TaSAP3定位在小麦5A染色体上,位于标记Xgwm186和Xgwml258之间,遗传距离分别为9.3 cM和7.7 cM。4、以262份自然群体为材料,对2010年至2012年的表型与标记进行关联分析,结果显示两个标记在多年多点的不同环境下均与产量性状千粒重、穗长显著关联。单倍型分析表明Hap-3A-3是优异单倍型,具有该单倍型的材料千粒重最高,利用小麦核心种质的部分材料进行验证,其结果与自然群体的关联分析结果一致。对不同年代育成品种的分析表明,单倍型Hap-3A-3受到了持续的正向选择;对其在中国十大麦区的分布分析说明,该单倍型在现代育种中的应用范围逐渐扩大。5、转TaSAP3基因拟南芥幼苗表现显著的渗透胁迫抗性,在高浓度NaCl与甘露醇处理下转基因株系根系与叶片能正常生长,而转空载和野生型植株则不能正常生长,逐渐变黄枯死。转基因植株的细胞膜稳定性比转空载和野生型植株表现出明显的优势。转基因水稻株系现在为T1代,将在后续研究中调查表型性状。通过酵母双杂实验,己初步筛选出互作基因,需要进一步验证与分析。
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