蘑菇作为一类高等真菌，能有效生产萜类、杂环化合物、聚酮化合物、甾醇等多种独特的生物活性物质。药用蘑菇灵芝是中国传统名贵中草药，其三萜类次级代谢物灵芝酸具有抗肿瘤、抗转移和抗HIV等多种重要的药理活性。但是，灵芝酸的含量和产量较低，需要通过现代生物工程技术来进一步提高，以满足大规模临床试验和商业应用的需求。近年来，信号转导工程作为一种提高高附加值次级代谢产物的方法，受到了广泛的关注。在一些子囊菌中，钙调磷脂酶信号参与次级代谢物的合成，但在高等真菌的另一分支担子菌中却未见报道。至今，有关钙调磷脂酶信号是否能够调节三萜合成及其调节机制均不清楚，所以，更不用说，在灵芝的发酵过程中，钙感应蛋白和灵芝酸合成基因对于钙调磷脂酶信号是如何响应。但是，这些信息对于提高发酵产量等应用将具有重要的意义。在本学位论文工作中，首先采用比较转录组分析的方法来研究振荡加静置的两阶段培养优于传统的全程振荡培养的分子机制。通过建立差减杂交文库，找到了在两阶段培养和全程振荡培养中差异表达的基因。通过对差减杂交文库中1920个cDNA进行分析，观察到147个unigenes在两阶段培养中上调。其中，与钙信号有关的钙调素、钙通道和钙库操纵性钙内流通道在两阶段培养中上调，暗示钙信号对于灵芝酸生物合成调控可能起着重要作用。因此，在以下的工作中，我们在两阶段培养中探索了钙信号对于灵芝酸合成的影响及其作用机理。首先，发现在静置培养开始时加入钙离子或钠离子或锰离子是提高灵芝酸产量的有效策略。钙离子、钠离子或锰离子的最优浓度分别为10mM，100mM和10mM。它们的总的粗灵芝酸产量（由分光光度法测定）最高分别达到1.58g/L，1.32g/L和0.96g/L，比未添加的对照样品分别提高了4.03，3.38和2.45倍。单体灵芝酸T，灵芝酸S和灵芝酸Me（由高压液相色谱分析）在添加10mM钙离子时达到最高，而灵芝酸Mk（由高压液相色谱分析）在添加100mM钠离子时达到最高。灵芝酸Mk，灵芝酸T，灵芝酸S和灵芝酸Me的最高产量分别为274.15±9.1mg/L，327.8±13.5mg/L，122.1±8.4mg/L和153.6±6.5mg/L，比未添加时分别提高了3.54，5.50，3.67和4.55倍。这是至今这些灵芝酸单体所报道的最高产量。据文献报道，在钠离子或锰离子或锂离子的较高盐浓度的压力下，胞内钙离子会迸发、进而促发钙信号来调节拟南芥中脱叶酸的生物合成。在本研究中，在加入钙离子、钠离子或锰离子的条件下，检测了发酵过程中灵芝细胞的钙离子流、钠离子流或锰离子流。当在培养基中加入钙离子，胞内钙离子水平显著提高，在第4天达到最高，而同时胞外钙离子浓度显著下降，在第4天降到最低，这暗示在高浓度的钙离子条件下，培养基中的钙离子在发酵初期内流，但在第4天以后，胞内的钙离子又逐渐流出到培养基中。当在培养基中加入钠离子或锰离子，观察到类似的胞内钠离子或锰离子的上升以及胞外钠离子或锰离子的下降的现象。而且，我们发现胞内钠离子或锰离子浓度的提升会导致培养基中的钙离子内流，暗示它们可能是通过促发钙信号来调节灵芝酸生物合成的。为了研究钙信号提高灵芝酸产量的分子机制，我们用钙调磷脂酶抑制剂（环孢霉素A）来研究钙调磷脂酶信号是如何调控灵芝酸生物合成的。在钙离子、钠离子或锰离子诱导下，实验发现孢子数、总的粗灵芝酸以及4种灵芝酸单体的含量均有提高，而在加入环孢霉素A的条件下，均有下降，并且在回补钙离子、钠离子或锰离子的条件下，环孢霉素A对孢子数、总灵芝酸和4种灵芝酸单体的抑制作用又有所一定程度被解除。这些实验结果表明钙离子、钠离子或锰离子可能是通过钙调磷脂酶信号来调节灵芝酸生物合成。为了进一步揭示胞内钙离子、钙调磷脂酶信号和灵芝酸生物合成之间的关系，我们用荧光法检测了胞内钙离子。添加钙离子、钠离子或锰离子的细胞发出了强烈的绿色荧光，这表明胞内的钙离子浓度很高。然而在添加环孢霉素A的细胞中，我们发现荧光强度显著降低，但在回补钙离子、钠离子或锰离子的细胞中，观察到荧光强度又有所加强。以上事实显示在钙离子、钠离子或锰离子诱导下，胞内钙离子的水平获得提升，钙调磷脂酶信号参与了其调节。为了进一步研究钙调磷脂酶信号调控灵芝酸生物合成的机制，在整个灵芝菌丝体发酵过程中检测了钙交换蛋白、钙感应蛋白和灵芝酸合成基因的转录水平。为了阐述钠离子或锰离子与钙调磷脂酶信号之间的关系，检测了钠钙交换蛋白（ENA1和ATPase）和锰钙交换蛋白（PMR1）的基因转录水平。结果表明钠离子诱导提高了ena1和Ca²⁺-ATPase的转录水平，锰离子诱导提高了pmr1的转录水平，但在加抑制剂的条件下，它们的转录水平都下调。这些数据表明在较高浓度的钠离子或锰离子浓度下，这些交换蛋白起到维持离子平衡，进而激活信号途径的作用。在添加钙离子、钠离子或锰离子的条件下，我们发现灵芝酸合成和钙感应蛋白基因的转录水平均有提高，而在添加抑制剂的时候，这些基因均下调。这与灵芝酸积累的规律变化相一致。以上结果表明，钙离子、钠离子或锰离子可能是通过上调这些基因的转录水平来提高灵芝酸产量的。由于灵芝酸合成基因的转录水平对于灵芝酸生物合成产量的重要作用，我们在以下的工作中尝试高表达灵芝酸合成基因。但是，众所周知，对蘑菇真菌（包括灵芝）的基因改造至今仍是一个难题。因此，我们首先在灵芝中建立了农杆菌介导（ATMT）的基因转化平台。在此基础上，通过高表达3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶（HMGR）基因，成功地使灵芝酸含量提高了约2倍。同时，中间代谢产物鲨烯和羊毛甾醇的含量也得到提高，下游合成途径中的法呢烯合酶、鲨烯合酶和羊毛甾醇合酶基因也得到上调。以上结果表明，通过转基因的方法改造灵芝酸的代谢途径具有良好应用前景的。综上所述，本学位论文首先用差减杂交的方法在两阶段培养体系中发现了100多个上调的基因，其中暗示钙信号对于灵芝酸生物合成调节的重要性。接下来在静置培养中通过添加钙离子、钠离子或锰离子，显著提高了灵芝酸的产量。通过检测胞内钙离子以及添加钙调磷脂酶抑制剂（环孢霉素A）实验，发现了添加钙离子、钠离子或锰离子会使培养基中的钙离子内流并促发钙调磷脂酶信号。之后又进一步在分子水平上研究钙调磷脂酶信号对灵芝酸合成的作用机理。本研究不仅提出了通过添加钙离子、钠离子或锰离子来高效生产灵芝酸的简便策略，而且还揭示了钙离子、钠离子或锰离子通过钙调磷脂酶信号来调控灵芝酸生物合成的机制。另外，通过开发基因转化系统并将能被钙调磷脂酶信号诱导的一个灵芝酸合成基因（hmgr）进行高表达，显著提高了总灵芝酸的含量。本文所提出的思路和策略有助于抗癌活性化合物灵芝酸以及其他蘑菇类次级代谢物的高效发酵生产。