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研究背景:类风湿关节炎（Rheumatoid arthritis,RA）是一种免疫介导的炎症性疾病,其以滑膜炎症为主要病理特征,可导致软骨破坏甚至关节功能丧失。研究表明巨噬细胞（Macrophages）和成纤维样滑膜细胞（Fibroblast-like synoviocytes,FLS）是滑膜炎症及软骨破坏的主要细胞,尤其是活化的巨噬细胞通过分泌肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor alpha,TNF-α）、白介素-1β（Interleukin-1β,IL-1β）和B细胞激活因子（B-cell activation factor,BAFF）等细胞因子促进炎症进程和组织损伤。而巨噬细胞中非活性菱形蛋白2（inactive rhomboid protein 2,i Rhom2）可促进TNF-α的分泌,同时TNF-α可诱导BAFF的表达。TNF-α和BAFF抑制剂能改善RA的炎症程度,延缓疾病的进展,因此,抑制i Rhom2及其介导TNF-α和BAFF的产生有望缓解RA的炎症进程。地塞米松（Dexamethasone,Dex）具有较强的抗炎、抗风湿和免疫抑制作用,可快速缓解RA患者关节肿胀和疼痛,减少骨侵蚀并降低TNF-α的水平而用于RA的治疗,且Dex可抑制RA巨噬细胞中TNF-α和BAFF的表达。但长期高剂量的Dex治疗会导致全身的毒副作用,如股骨头缺血性坏死、骨质疏松及骨折等。因此,若能将Dex有效地靶向递送至RA巨噬细胞内并减少给药次数和剂量,无疑能有效降低其副作用,从而提高其在RA中的应用。近年研究表明纳米颗粒（Nanoparticles,NPs）能够有效地将药物传递至病变部位,是一种可靠、有效,可应用于临床的策略。而RA巨噬细胞中叶酸受体（Folate receptor,FR）的高表达和活性氧水平（Reactive oxygen species,ROS）的显著升高为NPs的靶向输送提供了有益条件。基于以上分析,本课题制备了叶酸（Folate acid,FA）修饰的ROS响应性材料（Oxi-αCD）,并通过纳米沉淀自组装将Dex包裹并组装成纳米颗粒,探讨其是否能靶向关节炎症部位活化的巨噬细胞以及其在RA治疗中的作用及机制。研究目的:探讨ROS响应负载Dex的NPs对RA的治疗作用及分子机制。研究方法:1.通过化学反应合成ROS响应性材料Oxi-αCD和Cy5标记的Oxi-αCD,并对材料进行核磁共振氢谱表征。2.通过纳米沉淀法制备ROS响应的NPs,并对所制备的NPs进行透射电镜、纳米粒径、纳米颗粒分散性指数、Zeta电位表征以及冻干法检测载药率。3.通过半透膜透析实验检测Dex/Oxi-αCD NPs和Dex/FA-Oxi-αCD NPs的体外药物释放和水解机制。4.使用过氧化氢检测试剂盒测定NPs处理活化小鼠巨噬细胞Raw264.7内H2O2的含量。5.通过激光共聚焦检测小鼠巨噬细胞Raw264.7和人成纤维滑膜细胞MH7A对Cy5标记的NPs的摄取情况。6.采用q PCR实验检测MH7A细胞中三种FRs的m RNAs水平,WB实验检测Raw264.7和MH7A细胞中三种FRs的蛋白水平。7.Dex/Oxi-αCD NPs和Dex/FA-Oxi-αCD NPs处理活化的Raw264.7细胞后,采用q PCR检测i Rhom2的m RNA表达水平,WB检测i Rhom2、TNF-α和BAFF的蛋白的表达水平。8.采用CCK-8实验检测Dex/Oxi-αCD NPs和Dex/FA-Oxi-αCD NPs对Raw264.7细胞的细胞活性。9.通过观察给药治疗后CIA小鼠体重、血常规检测和主要内脏器官的H&E染色,评价Dex/Oxi-αCD NPs和Dex/FA-Oxi-αCD NPs的体内生物安全性。10.采用活体成像系统检测Cy5标记的Dex/Oxi-αCD NPs和Dex/FA-Oxi-αCD NPs在CIA小鼠体内的关节炎症靶向性和生物学分布。11.通过观察CIA小鼠给药治疗后的足掌厚度、AI指数和直接拍照观察,评价Dex/Oxi-αCD NPs和Dex/FA-Oxi-αCD NPs在CIA小鼠的体内抗炎效果。12.通过Dex/Oxi-αCD NPs和Dex/FA-Oxi-αCD NPs给药治疗后小鼠足掌关节的micro-CT、H&E和番红O染色,观察给药治疗后CIA小鼠的关节滑膜损伤和软骨侵蚀情况。13.通过ELISA检测CIA小鼠给药治疗后血清中细胞因子TNF-α和BAFF的表达。14.通过WB检测CIA小鼠给药治疗后关节组织蛋白中促炎基因i Rhom2、TNF-α和BAFF的蛋白的表达水平。研究结果:1.成功制备了形态规则、大小均一、200 nm左右的球形纳米颗粒,包括不载药的ROS响应性纳米颗粒（Blank/Oxi-αCD NPs）、负载Dex的ROS响应性纳米颗粒（Dex/Oxi-αCD NPs）、FA修饰的负载Dex的ROS响应性纳米颗粒（Dex/FA-Oxi-αCD NPs）以及Cy5标记的Dex/Oxi-αCD NPs和Dex/FA-Oxi-αCD NPs。2.半透膜透析实验表明Dex/Oxi-αCD NPs和Dex/FA-Oxi-αCD NPs在H2O2溶液中加速降解,且其可显著降低活化Raw264.7细胞内H2O2的含量。3.FRβ在Raw264.7细胞中的表达明显高于MH7A细胞,激光共聚焦检测证实Raw264.7细胞以时间依赖的方式有效摄取Dex/Oxi-αCD NPs和Dex/FA-Oxi-αCD NPs,且摄取Dex/FA-Oxi-αCD NPs能力更强,而MH7A细胞对NPs的摄取能力明显弱于Raw264.7细胞。4.Dex/Oxi-αCD NPs和Dex/FA-Oxi-αCD NPs以剂量依赖的方式显著抑制活化Raw264.7细胞中i Rhom2 RNA的表达以及i Rhom2、TNF-α和BAFF蛋白的表达,但不同浓度的Dex/Oxi-αCD NPs和Dex/FA-Oxi-αCD NPs对Raw264.7细胞活性无明显影响。5.Dex/Oxi-αCD NPs和Dex/FA-Oxi-αCD NPs在CIA小鼠中具有良好的生物安全性,Dex/FA-Oxi-αCD NPs积聚在CIA小鼠关节炎症部位能力最强且持续时间更久。6.Dex/Oxi-αCD NPs和Dex/FA-Oxi-αCD NPs治疗后明显减轻CIA小鼠关节的滑膜炎症和软骨侵蚀,且Dex/FA-Oxi-αCD NPs治疗效果更佳。7.Dex/Oxi-αCD NPs和Dex/FA-Oxi-αCD NPs治疗CIA小鼠后显著降低血清TNF-α和BAFF水平,且抑制CIA小鼠关节中i Rhom2、TNF-α和BAFF蛋白的表达,Dex/FA-Oxi-αCD NPs的抑制效果更显著。结论:1.成功制备了负载Dex的ROS响应纳米颗粒（Dex/Oxi-αCD NPs）、FA修饰的负载Dex的ROS响应纳米颗粒（Dex/FA-Oxi-αCD NPs）以及Cy5标记的Dex/Oxi-αCD NPs和Dex/FA-Oxi-αCD NPs。2.Dex/FA-Oxi-αCD NPs能主动靶向活化Raw264.7细胞中的FRs而被摄取,并能够有效地清除活化Raw264.7细胞内升高的H2O2,使NPs的球形结构崩塌释放Dex,释放的Dex通过抑制i Rhom2、TNF-α和BAFF的表达而抗炎。3.CIA小鼠体内实验证明Dex/FA-Oxi-αCD NPs具有良好的体内安全性和主动靶向性,可通过主动靶向到达炎症关节部位,并通过抑制i Rhom2/TNF-α/BAFF信号通路缓解CIA小鼠关节的滑膜损伤和软骨侵蚀,发挥抗炎作用。表明Dex/FA-Oxi-αCD NPs可作为RA治疗的新型候选策略。