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脊髓损伤(Spinal Cord injury,SCI)后神经功能修复一直是医学界极具挑战性的难题。近年来由于建筑业和交通运输业的高速发展,SCI发病率逐年增高。脊髓损伤常导致不同程度的肢体残障,给患者、家庭和社会带来极大痛苦及沉重经济负担。因此研究脊髓损伤后的病理生理变化,进而探索促进脊髓损伤后神经功能修复的治疗措施,减轻患者痛苦,提高其生活质量,已成为急待解决的主要课题。随着对脊髓损伤研究的不断深入,人们发现脊髓损伤后包括两阶段病理变化:一是原发性损伤,另一阶段是由原发性损伤引起的继发性损伤,而继发性损伤的损伤范围远大于原发性损伤,加剧了脊髓损伤的范围和程度。因此研究脊髓继发性损伤的病理机制,以及发现减轻继发性损伤的治疗手段已成为神经科学研究工作者一直致力追求的目标。研究表明,继发性损伤机理主要包括血管的破坏缺血、炎症反应、兴奋性毒性、自由基和脂质过氧化等(Tator, 1998),其中,炎症反应是继发性损伤发生发展的一个重要因素,但其产生机制还不完全清楚。在SCI后,细胞损伤及毒性物质可迅速诱发固有免疫应答,而CNS内固有的小胶质细胞是固有免疫应答的重要组成部分。小胶质细胞静息状态下,在中枢神经系统(central nervous system CNS)中起着监视作用,脊髓损伤后小胶质细胞迅速被激活并发生明显的形态变化,从静息多分支样转变成活化的变形虫样(Kreutzberg, 1996; Liu and Hong, 2003; Streit et al., 1988, 1999),小胶质细胞被激活后能够释放许多可溶性分子,并促进炎症反应,具有潜在的细胞毒性(如表1所示)。而且小胶质细胞表面的分子在其激活后也发生显著的变化(Graeber et al., 1988; Oehmichen and Gencic, 1975)。其中2003年研究报道Toll样受体(Toll like receptor, TLR)4在中枢神经系统主要表达在小胶质细胞(Lehnardt, 2003),在CNS固有免疫和适应性免疫应答的启动中均扮演着重要角色,近年来的研究开始关注TLRs在脊髓损伤中作用,但利用TLRs基因突变在体内和体外实验所得结论并不一致(Kigerl, 2007; Lehnardt, et al., 2003; Schonberg, 2007),为了明确TLRs与SCI后继发性损伤的关系,我们设计的试验分为两部分旨在研究脊髓损伤后TLR4在小胶质细胞表达的变化,以及其在脊髓损伤中的作用。第一部分研究了脊髓挤压伤后各时间点小胶质细胞TLR4的表达变化及其与损伤面积和免疫球蛋白G渗出范围的关系。本实验在成年雄性SD大鼠建立T8节段脊髓挤压伤模型;然后一半假手术对照组及挤压伤组动物在手术后0 h、3 h、24 h、72 h和7 d用4%多聚甲醛灌注固定,取以挤压点为中心的2cm脊髓,冰冻切片后进行H-E染色和免疫荧光染色,分别观察损伤面积的变化、Toll样受体4(TLR4)表达和TLR4阳性小胶质细胞的分布,以及与血浆免疫球蛋白G(IgG)渗出范围的比较,并用IPP软件计算各组的阳性数目。结果表明,脊髓损伤后TLR4主要表达在小胶质细胞,在3 h-24 h之间开始表达,伤后在72 h达到高峰,7 d时已经显著下降。阳性小胶质细胞的分布与IgG渗出范围一致。另外做一批假手术对照组及挤压伤0 h、3 h、24 h、72 h和7 d手术组,分别在各时间点进行麻醉、断头取材,提取总RNA ,进行TLR4的RT-PCR及real-time PCR扩增,结果显示在mRNA水平TLR4表达在3h与正常组没有差异,在72h达到高峰,7d明显下降。与H.E.染色显示的脊髓损伤面积变化的时程相一致,提示大鼠脊髓挤压伤模型中,表达在脊髓小胶质细胞上的TLR4可在脊髓继发性损伤中发挥重要作用。第二部分研究了TLRs在脊髓继发性损伤中的作用。本实验同样采用16只成年雄性SD大鼠建立T8节段脊髓挤压伤模型,并于挤压伤后在脊髓损伤中心缓慢注射TLRs信号通路中的关键分子MyD88的抑制剂(MyD88 inhibitor peptide, MIP) 5ul或缓慢注射对照肽(control peptide, CP) 5ul,并分别用浸有5ulMIP和5ulCP的明胶海绵覆盖损伤区,每组各4只,在7 d时用4%多聚甲醛灌注固定,取以挤压点为中心的2cm脊髓,冰冻切片后进行H-E染色和免疫荧光染色。每组另4只在7d断头活取以挤压伤为中心的2cm脊髓,进行制样以作P-P38 MAPK, IL-1,TNF-α及caspase-3的western blot试验。在整个试验过程中,用BBB评分及beam-walking试验观察对照组于给药组在行为学上的差别。结果显示,与对照组相比,MIP组使得大鼠脊髓损伤后运动功能恢复加快,脊髓组织凋亡细胞减少。并且凋亡细胞减少的原因可能是MIP阻碍了炎性因子的产生,这提示TLRs参与了脊髓继发性损伤,在早期阻碍TLRs信号通路能够减轻继发性损伤。综上所述,我们在蛋白水平及mRNA水平确定了大鼠脊髓挤压伤后TLR4表达的时程变化,并且其与脊髓损伤面积的变化趋势一致性提示小胶质细胞可能通过TLR4途径参与脊髓继发性损伤,在给与TLRs信号通路的MIP后,脊髓损伤得到较快的修复。证实TLRs通过MyD88信号途径参与了脊髓继发性损伤,为进一步研究TLRs参与脊髓继发性损伤的机制以及给与针对性治疗提供了依据。