背景缺血性脑卒中,是指由于各种因素引起的局部脑组织血液供应障碍,进而导致脑组织发生缺血缺氧性病变坏死,在临床上出现对应的神经功能缺失表现。该疾病的典型特点是：发病率高、死亡率高、致残率高、复发率高以及并发症多,且常留有后遗症,给社会及家庭带来沉重的负担,近年来,其发病年龄也逐渐趋向年轻化,越来越成为威胁人类生命和生活质量的重大疾患。因此寻找有效的治疗手段并阐释其作用机制一直是医学界研究的热点。目前已知脑梗死后50%以上的梗塞血管可以自发再通,当血流再通时,机体内的细胞受到相应的刺激后发生一系列复杂的病理生理变化,最终导致神经细胞死亡和迟发性神经细胞死亡,从而进一步促进脑缺血再灌注损伤后的神经功能破坏、脑梗死灶形成。医学上将这种由于梗塞血管血流再通所引起的局部组织损伤称为脑缺血再灌注(Cerebral Ischemia Reperfusion,CIR)损伤。其机制较为复杂,目前认为主要与过度形成的自由基、炎性反应兴奋性氨基酸毒性作用、细胞内Ca超载、基因异常表达等有关。大量文献报道丝裂原激活蛋白激酶级联途径参与脑缺血再灌注时神经细胞的损伤或修复,在细胞凋亡的信号传导方面起着关键性的作用。目前已确定的MAPK级联反应通路至少有6条,其中最具特征研究较多的有：1)细胞外信号调节蛋白激酶信号通路：其主要对酪氨酸激酶受体、生长因子受体、G蛋白偶联受体反应；2)应激活化蛋白激酶SAPK/JNK通路：主要针对TNFa、IL1和热反应等反应；3)p38MAPK通路：主要针对热休克、TNFα、IL.1等反应,当脑缺血再灌注发生时此3条主要信号通路在神经细胞以及星形胶质细胞中均被激活表达[6]。临床报道和实验研究已证实针刺疗法对缺血性脑卒中具有独特的疗效。导师课题组前期分别针对ERK信号通路、JNK信号通路以及p38MAPK信号通路展开研究,并取得了一定的成果,采用免疫组织化学法对三条通路相关蛋白p-ERK、p-JNK、p-p38MAPK进行检测分析,发现电针可以上调p-ERK的表达水平,也可以下调p-JNK、p-38MAPK的表达水平。推测电针治疗脑缺血再灌注损伤可能与促进ERK信号通路激活有关,也可能与抑制JNK信号通路、p38MAPK信号通路有关。并且在一定程度上为课题组前期提出的“针刺刺激—复合信号调控.良性修养机制启动是其脑缺血再灌注后治疗的关键作用机制之一”假说提供了依据。然而电针究竟是通过单纯影响某条通路起效,还是顺次逐一激活或抑制三条通路,亦或同时调节多条通路共同发挥作用,尚未完全明确。而且,据当前可查阅文献资料显示,对于该家族信号通路相关因子的检测方法,目前多采用免疫组织化学法、蛋白质免疫印记法(Western Blot)、逆转录PCR法(RT-PCR)等,这些方法虽然应用广泛,相对成熟,但是存在一定的局限性。而免疫荧光双标法则可以实现在同一组织或细胞标本上同时标记细胞内两种蛋白质。另外,激光共聚焦扫描显微镜(Confocal laser scanning microscope, CLSM)作为生物医学实验研究仪器中的新星之一,以其更高的图像清晰度,更强的指标观察灵敏度,以及更客观、精准的数据采集技术而愈来愈多地被应用于医学各个领域的研究中。由此,本课题采用免疫荧光双标记法同时对MAPK家族三条信号通路相关因子p-ERK、p-JNK、p-p38MAPK进行两两标记,通过在激光共聚焦扫描显微镜下观察电针干预对脑缺血再灌注后大鼠脑内MAPK家族三条信号通路的变化情况,进一步探讨电针治疗脑缺血再灌注损伤的可能机制。目的通过观察电针对脑缺血再灌注后大鼠神经功能缺损情况、局灶性脑梗死体积以及其脑内MAPK家族三条信号通路(ERK信号通路/JNK信号通路/p38MAPK信号通路)中相关蛋白(p-ERK/p-JNK/p-p38MAPK)的表达情况的影响,进一步探讨电针治疗脑缺血再灌注损伤的可能机制,为临床上电针治疗缺血性脑卒中提供科学的实验依据。方法1.实验动物分组：150只SD大鼠随机分为假手术组(Sham group)、模型组(IR group)和电针组(EA group),每组又分为2h(小时)、6h(小时)、1d(天)、3d(天)、7d(天)5个时间亚组,共15小组,每亚组10只。2.模型制备：本实验的动物模型是脑缺血再灌注大鼠,参照Zea Longa的方法,采用改良线栓法制备大鼠局灶性脑缺血再灌注模型。术前禁食12h,不禁水,具体造模方法如下：大鼠以10%水合氯醛(0.35m1/100g体质量)腹腔注射麻醉。仰卧位固定,剃去颈部毛发,碘伏棉球消毒皮肤备用。于左侧颈前正中线0.3cm处作2cm左右的纵形切口,用止血钳沿胸锁乳突肌内缘钝性分离皮下筋膜、肌肉及甲状腺等,暴露出左侧颈三角,分离出左侧颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)、颈内动脉(ICA)。在CCA远心端和近心端及ECA处挂线备用。用微动脉夹暂时夹闭ICA,然后近心端结扎CCA、ECA。在距CCA分叉部3mm处剪一小口,将栓线(预先蘸有肝素钠)插入到ICA,这时用绕在CCA远心端的细线轻轻系牢拴线。当栓线遇到动脉夹阻挡后,去除暂时阻断ICA血流的动脉夹,用眼科镊轻推栓线,调整进线角度,并轻轻牵拉颈总动脉,使栓线进入大脑,从血管分叉处开始算距离,当插入深度在1.8±0.5cm并有轻微阻力时停止,栓线经ICA分叉轻插入颅内至大脑前动脉(ACA),该深度恰好堵塞大脑中动脉(MCA)开口,然后紧紧系牢CCA远心端的细线。缺血30mmin后进行再灌注,将栓线头端拉出约1 cm至颈CCA,剪掉多余栓线。将手术后的大鼠进行单笼饲养观察。假手术组操作与上述步骤相同,只进行到暴露分离左侧颈三角,不行栓线栓塞,然后缝合皮肤切口,用碘伏棉球进行伤口消毒,单笼饲养观察。3.电针治疗方法：造模成功后,按照不同的分组分别施以相对应的处理。电针组大鼠造模成功后在规定时间点行电针治疗,选穴为“尺泽与合谷”,“足三里与三阴交”,电针波型选择疏密波,刺激频率为5-10Hz,电压约3-5V,以大鼠穴位周围组织轻微抖动为度,每次电针治疗时间为20 min。2h、6h、1d亚组只进行一次治疗,3d组每日行电针治疗,共计3次,7d组每日行电针治疗,共7次。在每天电针的同一时间同时抓取模型组和假手术组的大鼠进行固定,但不进行电针干预。4.观察指标：各组大鼠神经功能缺损情况、脑梗死体积以及MAPK家族三条信号通路的三种相关蛋白p-ERK、p-JNK、p-p38MAPK的表达水平。5.数据处理：用SPSS20.0上进行统计软件包进行数据处理。数据均采用均数±标准差(x±s)的形式表示,组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)、LSD检验,当P<0.05认为差异具有统计学意义。结果1.神经功能缺损评分：假手术组大鼠的神经行为学上的表现均未见异常,即,神经功能缺损评分为0分。模型组和电针组大鼠均出现不同程度的异常行为学表现,神经功能缺损评分在2-3分,两组各时间段与假手术组比较,均有统计学意义。说明脑缺血再灌注大鼠模型制备成功。其中,模型组2h亚组、电针组2h亚组与假手术组相比较,差异显著(P<0.01)。电针组与模型组比较,2h、6h、7d时两组神经功能缺损评分有统计学意义(P<0.05),1d、3d时,两组评分有显著性差异(P<0.01)。提示电针能减轻脑缺血再灌注后大鼠神经功能损伤程度,早期干预即产生作用,且随着时间的延长,治疗效果愈明显,3d时改善情况最佳,随后以较稳定的状态保持。2.脑梗死体积：从TTC染色后采集到的图像和数据分析得出,假手术组大鼠脑组织染色均匀一致,而模型组和电针组大鼠脑组织在不同时间段出现不同程度的梗死灶。与模型组比较,电针组6h亚组脑梗死体积差异有统计学意义(P<0.05),1d、3d、7d亚组脑梗体积差异较显著(P<0.01),说明电针治疗可以缩小缺血再灌注后脑梗死体积。3. p-ERK、p-p38MAPK的表达情况：假手术组各时间亚组p-ERK、 p38MAPK均有少量表达,各时间亚组间表达水平无差异(P>0.05)。模型组、电针组与假手术组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。模型组p-ERK、 p38MAPK两种指标在脑缺血再灌注2h时表达均有升高趋势,模型组p-ERK在6h迅速到达峰值后逐渐回落；p-p38MAPK在1d、3d时间点显示表达明显增多(P<0.01)。与模型组比较,脑缺血再灌注2h时,电针组即出现p-ERK表达的上调(P<0.05),1d、3d时间亚组上调明显,差异显著(P<0.01)。电针组p-p38MAPK的表达水平与模型组相比较均有所下降,电针治疗过程中p.p38MAPK表达抑制现象在3d时间亚组较明显(P<0.01)。4. p-JNK、p-p38MAPK的表达情况：电针可同时抑制p-JNK、p-p38MAPK的表达。各组各时间段p-p38MAPK的表达趋势大致同前片。p-JNK在假手术组大鼠脑组织中亦可见少量表达,但各时间亚组间差异无统计学意义(P>0.05)。与假手术组相比较,造模成功后的模型组和电针组,p-JNK阳性表达均有所升高,p-JNK约1d时达到峰值后出现回落。与模型组比较,脑缺血再灌注2h时,电针组即出现p-JNK表达的下降(P<0.05),电针组p-JNK的表达水平较同时段模型组均有所下降,6h、7d差异有统计学意义(P<0.05)；1d、3d亚组下降显著(P<0.01)。5. p-ERK、p-JNK的表达情况：假手术组各时间亚组p-ERK, p-JNK均有少量表达,各时间亚组间表达水平无统计学差异(P>0.05)。模型组、电针组与假手术组比较差异有统计学意义(P<0.05)。模型组p-ERK在2h即出现上调,在6h迅速到达峰值后逐渐回落；p-JNK约在1d时表达量达到最多。与模型组比较,脑缺血再灌注2h时,电针组即出现p-ERK表达的上调(P<0.05)以及p-JNK表达的下调(P<0.05),其中1d、3d时间亚组p-ERK上调明显,差异显著(P<0.01)。而p-JNK的下调6h、7d差异有统计学意义(P<0.05)；1d、3d亚组下降显著(P<0.01)。结论1.电针能缩小大鼠缺血再灌注后脑梗死体积,减轻缺血再灌注导致的神经功能损伤程度,提示电针能在一定程度上改善缺血再灌注引起的脑组织损伤。2.电针促进缺血再灌注引起的脑组织损伤修复,发挥脑保护作用的机制可能是良性综合调控MAPK家族信号通路的表达,即“针刺刺激一良性调节MAPK家族各信号通路相关蛋白表达.拮抗细胞凋亡.发挥脑保护作用”。