目的:探讨血管内皮细胞传代中的形态学变化及细胞周期的变化及其关系,应用TNF-α刺激对细胞衰老的进一步影响。方法:体外培养人脐静脉内皮细胞,通过传代及应用TNF-α干扰形成细胞的衰老模型。光镜及电镜下观察细胞衰老及未衰老的细胞形态结构及超微结构。结果:血管内皮细胞传代过程中随着细胞传代次数的增加,内皮细胞结构逐步退化。在代龄较低的细胞,生长速度较快。光镜下观察可见胞浆清澈透明,核清晰,核分裂相多见,细胞相互嵌合,为单层呈铺路石状排列。透射电镜下观察细胞形态规则,伪足较少。胞核呈圆形或卵圆形,核被膜略有曲折。线粒体数量多而密集;内质网发达多呈密集平行排列的扁束池状;染色质核内分布均匀。衰老细胞生长速度降低,分裂相少见。光镜下观察细胞排列稀疏,胞核清晰,大小不均,胞浆混浊,难于形成单层细胞,最终细胞自然脱壁悬浮死亡。电镜下细胞形态多样,体积缩小,伪足众多。细胞质致密,胞核明显不规则,出现核裂、曲核,核染色质浓集,边集于核被膜内侧,而核内其他部位的染色质趋于消失。线粒体和内质网数量明显减少,并且相当数量的线粒体和内质网肿胀、积水样变。代龄较低的细胞生长旺盛,处于S期的细胞明显多于传代及加用TNF-α后的同代细胞。细胞增值指数由25.82±1.83降至11.46±2.28。传代末期,细胞生长趋于停滞,死亡细胞增加。各代次细胞之间增值指数的差别有显著性意义。应用TNF-α刺激的内皮细胞细胞周期变化更为明显,细胞增值指数明显降低。结论:衰老内皮细胞细胞形态学发生明显变化。细胞器相应减少且细胞活性降低,抵抗外界有害因子能力降低,更新减慢。目的:探讨血管内皮细胞在复制性衰老过程中MCP-1 mRNA表达的变化; TNF-α干预对MCP-1 mRNA表达的进一步影响。方法:体外培养人脐静脉内皮细胞,选取第2、4、6、8代细胞融合达80%以上,应用胰蛋白酶消化分离。采用TRIZOL一步法提取细胞RNA。应用RT-PCR检测细胞MCP-1 mRNA的表达。干预组同样选取第2、4、6、8代细胞,生长融合达80%以上后,加用40ng/ml TNF-α24小时,同上检测细胞内MCP-1 mRNA的表达。结果: MCP-1 mRNA的表达在细胞传代前期中,随着代龄的增加而增加。传代末期,随着代龄的增加,其表达逐渐降低。应用TNF-α刺激的VEC,其MCP-1 mRNA表达显著增加,且随着细胞代龄的增加而增加。在传代末期,细胞功能退化,分泌功能明显降低,受到刺激后分泌功能下降也较为显著。结论:传代初期,细胞状态良好,无外界刺激的情况下,细胞分泌MCP-1较少。但是在传代过程中,单核细胞趋化因子-1随着传代的进展而分泌增加,在细胞完全老化之后,分泌功能降低,MCP-1分泌明显降低。应用TNF-α刺激后,内皮细胞MCP-1mRNA表达显著增加,分泌MCP-1随之增加。说明TNF-α可刺激其在体外培养的VEC表达上调,促进单核细胞向内皮下趋化和迁移。上述过程反映了细胞分泌功能随着细胞衰老而发生的变化。目的:探讨细胞线粒体膜电位及细胞内活性氧变化在EC衰老中的变化规律和意义。方法:体外培养人脐静脉内皮细胞,选取第2、4、6、8代细胞融合达80%以上,应用胰蛋白酶消化分离。用流式细胞仪检测细胞线粒体膜电位、细胞内活性样的变化。对于第2、4、6、8代细胞生长融合达80%以上后,加用40ng/ml TNF-α24小时,用胰蛋白酶消化分离后进行细胞周期、线粒体膜电位、细胞内活性氧检测。结果: (1)随着传代的增加,线粒体膜电位也发生明显的变化。线粒体膜电位逐渐下降。应用TNF-α刺激的内皮细胞线粒体膜电位下降更为显著。(P<0.05)。(2)第二代细胞中的活性氧含量较低。随着传代次数的增加,细胞内的活性氧含量逐渐增加,至代龄较高的细胞,胞内活性氧减少。各代次细胞含活性氧之间差别有显著意义。应用TNF-α刺激的低代龄内皮细胞ROS增加更为显著。在传代末期ROS明显降低。结论:细胞衰老过程中线粒体膜电位逐渐降低。而细胞内活性氧随着代龄的增加先增高后降低。