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胶质瘤是成人最常见的原发性脑肿瘤,活跃的微血管增生与恶性胶质瘤,尤其多形性胶质母细胞瘤(glioblastoma multiforme,GBM)的高侵袭性和不良预后密切相关。尽管近年来胶质瘤的抗血管生成治疗取得了一定进展,但由于胶质瘤血管新生化的复杂机制,某些血管靶向药物引发了相应的化疗抵抗,亟需鉴定胶质瘤源性血管形成的特异性调控因子。芽生式血管生成曾被认为是肿瘤血管形成的唯一方式。最近,研究发现肿瘤干细胞(cancer stem cells,CSCs)和恶性肿瘤细胞可衍生为血管组成细胞,从而构成新的肿瘤供血管道,这为我们深入认识肿瘤血管新生化的机制展示了一个新的视角。肿瘤血管新生化常涉及胚胎血管发育中某些分子调控途径的再活化。值得注意的是,胚胎发育中,神经干细胞(neural stem cells,NSCs)和血管内皮细胞(endothelial cells,ECs)共定位于一个神经血管单元,神经形成和血管发生之间相互促进,且存在共同的调控因子,而且有研究报道NSCs转分化为ECs。已有研究证明,在胶质瘤的发生和演进中,胶质瘤干细胞(glioma stem cells,GSCs)和肿瘤血管内皮细胞(tumor endothelial cells,TECs)之间也存在如此的动态相互作用,也有研究相继报道GSCs或GBM瘤细胞转分化为TEC。神经胶质成熟因子-β(Glia maturation factor-β,GMF-β)最早被界定为一种神经胶质分化因子,该因子介导胶质细胞的分化和某些神经元的生长,还可促进神经组织再生。既往研究显示GMF-β可负反馈调控胶质瘤细胞增殖,促其胶质分化,并可介导胶质瘤细胞的某些化疗敏感性。然而,另有研究报道,乳腺癌和卵巢癌组织中GMF-β过表达与临床不良预后相关。基于胶质瘤中神经分化和血管发生之间可通过共同调控因子相互促进的研究背景,并结合GMF-β在胶质瘤和其它肿瘤中多面作用的报道,本课题组假设,作为神经胶质分化因子的GMF-β也可能介导胶质瘤细胞构成肿瘤新生血管,从而参与促进胶质瘤恶性进展。我们首先检测各级胶质瘤中GMF-β表达模式,并分析其与血管新生的关系及其临床意义,又进一步从体外观测GMF-β是否可介导恶性胶质瘤细胞体外成管以及内皮转分化,最后在异种原位移植胶质瘤模型中验证gmf-β介导恶性胶质瘤细胞转分化为tec的作用。主要方法、研究结果及结论如下:1.通过联合应用gmf-β/cd31免疫组织化学双标染色和过碘酸雪夫氏(periodicacid-schiff,pas)组织化学染色技术,检测146例各级别人胶质瘤组织样本中gmf-β表达模式,并统计分析其与微血管密度(microvesseldensity,mvd)、预后和其它临床病理参数的关系。①在各级别胶质瘤的肿瘤细胞和瘤内微血管内皮细胞中均检测到gmf-β表达,且肿瘤细胞和血管内皮中gmf-β表达水平不仅与胶质瘤级别正相关(p<0.001;p<0.0001),也与mvd线性正相关(r=0.367,p<0.001;r=0.557,p<0.0001);②gbm中微血管旁胶质瘤细胞的gmf-β表达水平显著高于远离微血管的胶质瘤细胞(p<0.0001),而且与肿瘤血管内皮gmf-β表达水平以及mvd之间均存在线性正相关关系(r=0.770,p<0.0001;r=0.620,p<0.0001)。③肿瘤血管内皮的gmf-β高表达是胶质瘤患者不良预后的独立预测指标。虽然kaplan–meier生存曲线和单因素cox回归分析显示胶质瘤细胞和肿瘤血管内皮的gmf-β表达是胶质瘤患者的不良预后指标(p值均<0.001),进一步多因素cox回归分析明确了肿瘤血管内皮细胞的(而非肿瘤细胞的)gmf-β表达水平是胶质瘤患者pfs(风险比1.244,95%可信区间1.136-1.363,p<0.0001)和os(风险比1.236,95%可信区间1.126-1.358,p<0.0001)的独立预测指标。④胶质瘤细胞和肿瘤血管内皮的gmf-β表达水平与其它临床参数的相关性。pearsonχ2检验分析显示gmf-β表达与某些不良预后指标以及放化疗情况相关。瘤细胞gmf-β高表达与高肿瘤级别、高ki67增殖指数以及患者接受放疗均存在显著相关性(p值均<0.05)。肿瘤血管内皮gmf-β高表达与高肿瘤级别、患者高龄(p值均<0.001)以及患者接受化疗和放疗均存在显著相关性(p值均<0.05)。另外,肿瘤血管内皮gmf-β表达与胶质瘤发生部位相关,颞叶胶质瘤呈现血管内皮gmf-β高表达趋势(p值<0.05)。2.通过慢病毒过表达/干扰载体的构建,相应上调/下调人胶质母细胞瘤u87细胞的gmf-β基因(gmfb)表达,观测gmf-β对u87细胞体外成管和内皮转分化的作用。①应用二维基质胶成管实验,评估u87胶质瘤细胞的体外血管发生活性,发现u87细胞成管能力依赖于内皮细胞生长培养基。“模式评分”和“分支点计数”两种量化系统评估显示,u87细胞成管能力低于脐静脉内皮细胞huvec(p值均<0.05)。②内皮细胞生长培养基中加入去铁胺(deferoxamine,dfo)模拟的缺氧条件,诱导u87细胞中gmf-β和内皮特异标记cd31mrna表达平行上调。③gmf-β敲低导致u87细胞成管能力下降,U87-sh GMFB细胞的成管能力显著低于对照组U87-mock细胞(P<0.001;P<0.0001)④GMF-β敲低抑制U87细胞体外增殖活性,与U87-mock组对比,U87-shGMFB组瘤细胞增殖被显著抑制(P<0.05)。⑤U87-OE-GMFB细胞中GMF-β过表达相应上调内皮特异标记CD31mRNA表达,U87-sh GMFB细胞中GMF-β敲低则下调CD31m RNA表达。3.我们在鼠原位移植胶质瘤模型中,进一步验证GMF-β介导胶质瘤细胞衍生TECs的作用。所有异种移植U87人胶质瘤组织样本均进行免疫组化人GMF-β/CD31双标染色。①GMF-β过表达导致异种原位移植U87胶质母细胞瘤内瘤细胞源性新生血管增多以及荷瘤鼠生存期缩短。统计分析显示,与U87-vector对照组比较,U87-OE-GMFB组荷瘤鼠生存期显著缩短(P<0.01),而且U87-OE-GMFB组移植瘤中人CD31阳性微血管密度显著增高(P<0.001)。②GMF-β敲低导致异种原位移植U87胶质瘤内瘤细胞源性血管缺如以及成瘤抑制。统计分析显示,与U87-mock组比较,U87-shGMFB组移植瘤体积显著减小(P<0.0001)伴人CD31阳性微血管密度显著降低(P<0.001)。综上所述,人胶质瘤细胞和肿瘤血管内皮细胞中均存在GMF-β的特异表达,而且与胶质瘤级别、MVD和临床预后显著相关,尤其TECs中GMF-β高表达是胶质瘤患者不良预后的独立预测指标。GMF-β介导U87胶质母细胞瘤细胞的体外成管和CD31表达,促进U87细胞原位移植瘤的瘤体生长以及瘤细胞源性血管形成。我们的研究结果提示GMF-β可作为一个新型的胶质瘤诊断标记和预后指标,并有望为胶质瘤血管靶向治疗提供一个具有细胞特异性的分子靶点。