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研究目的:铅是一种自然界广泛存在的有毒重金属,铅暴露可造成机体多个系统的损伤,尤其是对神经系统的损伤。铅的神经毒性一直备受关注,但其毒性机制至今仍未完全阐明。大量的研究发现,神经元限制性沉默因子(Neuron-restrictive silencer factor,NRSF)在神经系统发育过程中具有十分重要的作用,它是一种含锌指结构的转录因子,能特异性的与神经元限制性沉默元件(Neuron-restrictive silencer element,NRSE)结合,来抑制含NRSE基序的神经特异性基因的转录,这些基因对形成并维持神经元的表型、神经元突触可塑性有十分重要的作用。突触囊泡蛋白2C(Synaptic vesicle glycoprotein 2C,SV2C)在神经递质的释放和突触的传递中起着重要的作用,我们前期研究发现铅暴露可导致小鼠神经母细胞瘤细胞(Neuro-2a,N2a)中SV2C的m RNA和蛋白质水平明显下调,但铅是如何改变SV2C基因的转录水平仍不清楚。通过生物信息学技术发现SV2C启动子区含有NRSE基序。故本研究建立铅暴露大鼠模型,探讨铅暴露对大鼠海马NRSF和SV2C表达的影响。以及建立体外培养的N2a细胞铅暴露模型,探讨铅暴露对N2a细胞NRSF和SV2C表达的影响。最后,在铅暴露的N2a细胞模型基础上干扰NRSF的表达,观察铅暴露是否通过影响NRSF的表达来调控SV2C的转录水平。本研究为铅暴露引起的神经毒性机制提供线索,并为寻找新的治疗铅中毒药物提供理论依据。实验方法:1、铅暴露对断乳SD大鼠海马NRSF和SV2C表达的影响:性成熟雌性SD大鼠随机分为空白对照组(双蒸水)、低(0.5 g/L)、高(2.0 g/L)剂量醋酸铅暴露组,采取自由饮水方式进行醋酸铅暴露,连续暴露10 d后,按雌:雄为2:1合笼交配,将受孕成功的雌性大鼠继续饮水方式暴露醋酸铅,直至仔鼠断乳(出生后3周)。雄性仔鼠在断乳时,采用Morris水迷宫系统检测大鼠的学习记忆能力;采用电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP-AES)检测大鼠全血和海马组织中铅含量;采用逆转录-聚合酶链反应(Reverse transcriptase polymerase chain reaction,RT-PCR)检测大鼠海马NRSF和SV2C m RNA表达情况;进行蛋白免疫印迹法(Western blot,WB)检测大鼠海马NRSF和SV2C蛋白表达情况;采用免疫荧光法(Immunofluorescent,IF)检测NRSF蛋白在大鼠海马组织各区域的表达情况。2、铅暴露对N2a细胞NRSF和SV2C表达的影响:在N2a细胞贴壁生长稳定后,加入浓度梯度为0μM(空白对照组)、1μM和100μM的醋酸铅进行染铅处理培养48 h后,使用RT-PCR法检测N2a细胞NRSF和SV2C m RNA的表达情况;采用IF法检测NRSF蛋白的表达情况。3、NRSF对SV2C m RNA的影响:100μM的醋酸铅处理两组N2a细胞,沉默组转染NRSF-si RNA,对照组转染DDW,转染后两组同时铅暴露处理48 h,使用RT-PCR和Western blot法分别检测NRSF m RNA及蛋白水平的表达变化,采用RT-PCR法检测SV2C m RNA的表达变化。实验结果:1、铅暴露会引起大鼠的学习记忆能力下降:Morris水迷宫获得性训练实验中发现,各组大鼠在训练第4 d的平台逃避潜伏期总体上存在显著差异。第4 d各组大鼠潜伏期时间随着铅暴露剂量增加呈现浓度依赖性延长(P<0.05)。Morris水迷宫空间探索实验发现,与空白对照组相比较,低、高剂量铅暴露组穿越平台次数更少,差异有统计学意义(P<0.05),且低、高剂量铅暴露组间比较也有统计学差异(P<0.05)。2、铅暴露会引起大鼠的血铅和海马组织铅水平增加:ICP-AES检测表明,大鼠血铅浓度和海马铅含量均随着铅暴露浓度增加而增加,且呈现一定的剂量反应关系(P<0.05)。3、铅暴露影响大鼠海马NRSF的表达:RT-PCR检测发现,大鼠海马NRSF m RNA表达水平随着铅暴露浓度增加呈现剂量反应性增加(P<0.05)。WB检测发现,NRSF蛋白表达水平也随着铅暴露浓度增加呈现剂量反应性增加(P<0.05)。IF检测发现,海马CA1、CA3以及DG区NRSF蛋白表达水平随着铅暴露浓度的增加呈剂量反应性增加(P<0.05)。4、铅暴露影响大鼠海马SV2C的表达:RT-PCR检测发现,大鼠海马SV2C m RNA表达水平随着铅暴露浓度增加呈现剂量反应性下降(P<0.05)。WB检测发现,SV2C蛋白表达水平也随着铅暴露浓度增加呈现剂量反应性下降(P<0.05)。5、铅暴露影响N2a细胞中NRSF的表达:RT-PCR检测发现,N2a细胞NRSF m RNA表达水平随着铅暴露浓度增加呈现剂量反应性增加(P<0.05)。IF检测发现,随着铅暴露浓度的增加,N2a细胞NRSF蛋白表达水平增强,且呈剂量反应关系(P<0.05)。6、铅暴露影响N2a细胞中SV2C m RNA的表达:RT-PCR检测发现,N2a细胞SV2C m RNA表达水平随着铅暴露浓度增加呈现剂量反应性下降(P<0.05)。7、在100μM的醋酸铅作用下,与对照组相比,NRSF沉默组N2a细胞NRSF m RNA及蛋白的表达水平均显著下调(P<0.05),而SV2C m RNA表达水平显著升高(P<0.05)。结论:铅暴露通过上调NRSF的表达来抑制其下游靶基因SV2C的转录水平,导致下调了SV2C m RNA的表达,从而影响神经递质的释放和突触的传递,进而影响神经元突触可塑性,引起学习记忆的损伤,这为探讨铅的神经毒性机制提供理论依据,并为寻找治疗铅中毒的新药物提供新思路。