背景:乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一,70%的乳腺癌患者呈现为雌激素受体(Estrogenreceptor,ER)表达阳性,雌激素结合ER后激活下游信号通路能够促进肿瘤的发生发展。女性体内的雌激素是促进ER阳性的乳腺癌细胞生长重要的信号分子,因此,有效的阻断雌激素受体信号通路是治疗乳腺癌中重要的靶点。他莫昔芬(Tamoxifen,TAM)是雌激素受体拮抗剂药物,能和雌激素竞争性结合ER,抑制雌激素受体介导的下游信号通路从而引起ER阳性的乳腺癌细胞的凋亡。因此,他莫昔芬成为ER阳性乳腺癌患者中首选药物,然而临床实践发现40%的患者在治疗过程中会发生继发性耐药,乳腺癌细胞对他莫昔芬产生耐药的机制目前尚不清楚。研究表明他莫昔芬的作用机制就是剥夺了乳腺癌细胞生长中必要的生长激素,导致乳腺癌细胞的增殖、迁移受阻。这一机制与细胞应激中生长信号被剥夺的方式相似,肿瘤细胞发生应激后极有可能激活压力应激信号通路,进而改变肿瘤细胞的生物学行为以及代谢的方式。肿瘤细胞行为所产生的改变会以多种信号调节的方式作用于肿瘤细胞微环境中。肿瘤微环境通常是由肿瘤细胞、间质细胞、免疫细胞,微血管组成,肿瘤微环境与肿瘤细胞的相互作用决定了的肿瘤的发生、发展、耐药和转移的进程。在相互作用中以免疫细胞和肿瘤细胞的之间的相互作用尤为重要,并且在众多的免疫细胞中巨噬细胞在调控肿瘤微环境中的作用处于核心地位。研究表明,肿瘤微环境中的巨噬细胞接受微环境中细胞因子、mi RNA以及外泌体的调节,转变为肿瘤相关巨噬细胞。肿瘤相关巨噬细胞通常极化为免疫抑制型的巨噬细胞(M2型),该型巨噬细胞表达多种炎症抑制的细胞因子,抑制炎症反应。这种微环境为肿瘤细胞创造了低反应免疫应答的状态,为肿瘤的发展提供了有利的条件。因此,巨噬细胞的极化方向的改变对肿瘤的发展转归至关重要。巨噬细胞的极化可以通过细胞因子与受体的方式发挥作用,这种通过细胞因子介导细胞间信号传导的方式是极有可能是乳腺癌细胞受到他莫昔芬的应激后发生耐药的重要途径。综上所述,探索他莫昔芬引起的乳腺癌细胞应激后产生的细胞因子对巨噬细胞极化的影响对解释ER阳性乳腺癌细胞的耐药机制有着重要的意义。目的:本课题拟在体外环境中,观察4羟基他莫昔芬(4-Hydroxy-Tamoxifen,4-OHTAM)对MCF-7乳腺癌细胞压力应激信号通路的影响,进而比较应激状态与未应激的乳腺癌细胞释放的细胞因子调节巨噬细胞极化的差异。分析巨噬细胞表型及炎症因子的变化,确认巨噬细胞极化方向。从而阐明细胞因子介导的信号途径在他莫昔芬应激的乳腺癌细胞对巨噬细胞极化方向的作用。所得的研究结果将从应激释放细胞因子促进巨噬细胞M2型极化的角度解释乳腺细胞对他莫昔芬的耐药机制。方法1、利用MTT实验确定4-OHTAM引起MCF-7应激的浓度,并设定合理的浓度梯度做对照;进一步采用流式细胞仪凋亡模式确认不同浓度4-OHTAM引起MCF-7凋亡作用;蛋白印迹法检测MCF-7应激蛋白的表达,确认一定浓度的4-OHTAM引起MCF-7应激反应。2、将不同浓度的4-OHTAM刺激MCF-7乳腺癌细胞2h和5h提取的上清与佛波酯(Phorbol 12-Myristate 13-Acetate,PMA)诱导6h的THP-1细胞继续培养66h,收集每组贴壁巨噬细胞及其上清。ELISA检测贴壁巨噬细胞上清中的细胞因子(IL-10、IL-1Ra),根据450nm处的吸光度值绘制标准曲线,计算各组样本中细胞因子的水平;BCA蛋白试剂盒测定巨噬细胞中蛋白浓度;免疫印迹法检测贴壁巨噬细胞中各组样本CD206、IL-1Ra蛋白表达;倒置相差显微镜观察贴壁巨噬细胞形态;流式鉴定巨噬细胞表型。结果1、各浓度4-OHTAM刺激MCF-7细胞2小时,细胞活力无明显变化;延长刺激时间至5小时,细胞活力随药物浓度的递增明显减弱,且凋亡率随药物浓度的增加而升高;5μmol/L 4-OHTAM刺激MCF-7细胞2小时,两组间GRP78和CHOP蛋白表达无显著性差异,5μmol/L 4-OHTAM刺激MCF-7细胞5小时后,GRP78和CHOP蛋白表达上调,高于对照组GRP78和CHOP的表达水平。2、5小时组贴壁巨噬细胞上清中各药物浓度间IL-10和IL-1Ra水平差异有统计学意义,4-OHTAM浓度为5μmol/L时上清液中各细胞因子水平最高。3、5小时贴壁巨噬细胞中各药物浓度间CD206和IL-1Ra各组间比较差异具有统计学意义,且在4-OHTAM浓度为5μmol/L时表达最高。巨噬细胞具备M2型巨噬细胞形态学特征,且细胞表型鉴定高表达CD206、Arg-1低表达TNF-α。结论1、4-OHTAM引起MCF-7乳腺癌细胞内质网应激。2、内质网应激释放的细胞因子可以促进巨噬细胞M2型极化。