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温度是生物体的生理特征和行为特征的主要决定因素之一,并且对生物的生存和分布有着重要的影响。鱼类作为生物圈内脊椎动物中数量最庞大、种类最繁多、分布范围最广的类群,其如何应对温度变化一直以来是生物学的一个研究热点。另外,鱼类作为变温动物,对水温有一定的耐受范围,当温度降低到耐受极限时,鱼类生理学功能会发生混乱,最终导致死亡。所以,为了提高鱼类在低温胁迫下的耐受能力,对鱼类在冷适应和冷刺激下的研究具有非常重要的意义。自噬在应激条件下高度上调,可以消除生物细胞因突然暴露于不良环境时产生的错误折叠的蛋白质或受损伤的细胞器（如线粒体）,通过把大分子物质分解成小分子物质再重新利用,以此来维持细胞在逆境下的存活或细胞器的更新。但有些研究也表明自噬过度表达可以促进细胞的死亡,所以细胞对自噬精确的调控机制非常重要。本实验室前期研究发现,低温下斑马鱼ZF4细胞自噬水平上升,并且上升的程度随温度的降低程度而增加,证明了自噬在低温下对细胞的保护作用。但是自噬在鱼类低温胁迫下的上游调控机制仍不清楚。值得注意的是,有研究发现赖氨酸特异性去甲基酶4A（KDM4A）对肿瘤细胞和果蝇中自噬的发生具有调节作用。赖氨酸特异性去甲基化酶4A基因（kdm4A）是kdm4亚家族成员,是从酵母细胞到人的保守基因,具有多种重要的生物学作用,目前对kdm4A比较深入的研究是其去甲基化酶活性以及该基因在控制转录,染色质结构和细胞分化中发挥的关键作用。本实验室前期对低温胁迫下斑马鱼ZF4细胞的RNA-seq测序结果分析发现kdm4aa表达量显著降低。提示kdm4aa可能是一个重要的调控基因,该基因在冷刺激下降低表达可能对细胞起到一种保护作用。但是对该基因在鱼类冷适应中的功能还没有相关的研究。kdm4A在斑马鱼ZF4细胞中有两种类型kdm4aa和kdm4ab。我们对低温处理1d、5d和30d的斑马鱼ZF4细胞提取RNA,利用RT-qPCR技术检测kdm4aa和kdm4ab的表达情况,结果显示二者在低温下表达量均显著降低,这与我们先前的转录组数据结果相同。为了研究kdm4aa和kdm4ab否对斑马鱼ZF4细胞的自噬水平有调控作用,本研究针对这两个基因的编码区设计了两个shRNA和一个不起任何作用的短发夹结构,命名为nc。然后,经EcoRI和Age1酶切构建plko.1-shkdm4aa、plko.1-shkdm4ab和plko.1-Negative Control（NC）的重组质粒,并分别与慢病毒包装质粒pCMV-DR8.9.1、pCMV-VSVG共同转染至HEK-293T细胞中,收集在HEK-293T细胞中包装的病毒,感染斑马鱼（Danio rerio）胚胎成纤维样细胞（zebrafish embryos fibroblast like cell line,ZF4）。RT-qPCR结果显示kdm4aa和kdm4ab被成功敲降。我们从转录水平及翻译水平来检测自噬相关基因beclin1和LC3的表达情况。发现敲降kdm4aa的ZF4细胞与sh-NC组相比自噬相关基因beclin1及LC3的表达量均显著上调,而敲降kdm4ab的细胞变化不显著。随后,我们将细胞转移至18℃培养箱继续培养1d,使用台盼蓝染色法进一步检测了敲降kdm4aa和kdm4ab在低温下对细胞存活率的影响。结果显示,在18℃低温处理1d后,敲降kdm4aa的细胞与对照组相比存活率显著上升,而敲降kdm4ab的细胞存活率无明显变化。然而在细胞低温处理的同时加入自噬抑制剂Bafilomycin A1（4nmol/L）,发现抑制自噬后能逆转kdm4aa敲降导致的存活率升高,使细胞存活率又显著下降。以上结果说明,敲降斑马鱼ZF4细胞的kdm4aa基因通过上调自噬在低温压力下减少细胞死亡。本实验室之前的研究还发现,短期低温胁迫下ZF4细胞的ROS水平会上升。鉴于ROS主要来源于受损伤的线粒体,而自噬参与了受损伤线粒体的清除,所以我们进一步检测了自噬与DNA损伤的关系。通过敲降和过表达自噬相关基因beclin1后给予细胞18℃低温刺激来检测1d后DNA损伤情况。结果显示,敲降beclin1后,在冷刺激下相对于对照组细胞DNA损伤增加,表现为DNA损伤标志蛋白γH2A.x显著增加。而过表达beclin1的细胞,在冷刺激下相对于对照组细胞DNA损伤减少。该实验结果证明,低温下斑马鱼ZF4细胞的DNA损伤水平受自噬的影响。总之,本研究证明了kdm4aa在斑马鱼ZF4细胞自噬的产生中起到重要调控作用,并且在低温下敲降kdm4aa可以通过上调的自噬来增加细胞存活率,而kdm4ab对自噬及细胞存活率没有影响。另外,我们通过对自噬进一步研究发现,低温下抑制自噬可以导致斑马鱼ZF4细胞DNA损伤增加,而上调自噬可以降低斑马鱼ZF4细胞DNA损伤水平。总之,本研究证明了自噬在低温下对细胞的保护作用。该研究为后期对斑马鱼细胞自噬的相关研究奠定了基础,为低温下研究鱼类内源性基因的分子机制提供新的思路。为提高鱼类低温耐受能力提供了可能。