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目的:本课题通过构建小鼠骨癌痛模型,观察骨肿瘤进展过程对GABA能中间抑制性神经元铁死亡的影响。通过干预铁死亡的发生,观察其对小鼠疼痛行为学的影响、神经递质表达改变和铁死亡相关蛋白表达改变。阐明脊髓GABA能神经元铁死亡与小鼠骨癌痛的关系,进而探索可有效改善骨癌痛治疗的方法。方法:1.取8周龄雄性C57BL/6小鼠共计52只,体重约20-25g,按随机数字表法分为2组:骨癌痛组（BCP组,n=40）和对照组（Sham组,n=12）。其中BCP组通过注射含有肿瘤细胞的培养基建立骨癌痛模型;对照组在同侧膝关节切开后,仅注入等体积的含有灭活肿瘤细胞的培养基。分别于造模前和造模后第5、10、15、20天（n=8）测量各组小鼠造模侧后肢的行为变化,包括:机械缩足阈值（paw withdrawal mechanical threshold,PWMT）、热刺激缩足反应潜伏期（paw withdrawal thermal latency,PWTL）、机械缩足频率（withdrawal frequency）和10分钟内自发性缩足次数（spontaneous lifting）。通过体内成像技术和骨组织切片的HE染色观察骨肿瘤的生长情况。BCP组在造模后第5、10、15、20天和假手术组在相应的第20天取脊髓腰膨大部分。Western blot检测各组脊髓GABA蛋白表达变化（n=6）;免疫荧光法观察各组小鼠双侧脊髓GABA分布（n=4）。第20天使用ELISA法检测定各组脊髓神经元氧化应激水平（n=4）,免疫电镜观察各组小鼠脊髓GABA能神经元细胞及其线粒体改变（n=2）。2.另取8周龄雄性C57BL/6小鼠共计30只,随机分为3组（n=10）:溶媒组（BV组）、对照组（SV组）、抑制剂组（BF组）。在成功建立骨癌痛模型后,BF组每日以10mg/kg的剂量腹腔注射Ferrostain-1,BV组腹腔注射等体积DMSO混合溶剂,SV组则在假手术的基础上腹腔注射等体积DMSO混合溶剂,连续给药20天。各组于造模前及造模后第5、10、15、20天测定痛阈、机械缩足频率和10分钟内自发性缩足次数（n=8）,于术后第20天取各组脊髓腰膨大;使用蛋白质印记法检测GABA蛋白、COX-2蛋白和铁死亡相关蛋白的表达改变（n=6）;免疫荧光法观察各组脊髓GABA蛋白的变化（n=4）,免疫电镜观察细胞及线粒体超微结构改变（n=2）。3.另取8周龄的雄性C57BL/6小鼠共计32只,随机分为4组（n=8）:通过上述方法完成骨癌痛建模后,分为溶媒组（BCP+Vehicle组）和抑制剂组（BCP+FER-1组）,再将每组根据注射药物的不同分为帕瑞昔布组（parecoxib组）和生理盐水组（NS组）。parecoxib组于造模后第20天腹腔注射10mg/kg帕瑞昔布,NS组于第20天腹腔注射等体积生理盐水。注射完成后,测量各组小鼠的行为。结果:1.与对照组相比,骨癌痛模型小鼠术侧后肢术后第5天开始出现明显的机械痛阈与热痛阈的下降,并可持续至第20天（p＜0.05）,伴随有机械缩足频率和10分钟内自发性缩足次数增加（p＜0.05）;活体成像技术观察到小鼠股骨肿瘤逐渐增大,股骨切片HE染色可见骨髓腔内肿瘤细胞,以上结果表明模型建立成功。Western blot和免疫荧光结果显示脊髓GABA蛋白于第5天下降并持续到第20天（p＜0.05）。使用ELISA法测得骨癌痛组小鼠脊髓内丙二醛（MDA）和活性氧（ROS）的水平较对照组增加（p＜0.05）,同时超氧化物歧化酶的水平（SOD）和谷胱甘肽（GSH）的水平降低（p＜0.05）。免疫电镜观察发现骨癌痛组小鼠脊髓GABA能神经元线粒体收缩,双层膜密度增加。2.溶媒组（BV组）与对照组（SV组）相比,机械痛阈及热痛阈均降低（p＜0.05）;同时机械缩足频率和自发缩足次数均增加（p＜0.05）;BV组与抑制剂组（BF组）相比,后者的机械痛阈值和热痛阈值从接种后第5天开始升高（p＜0.05）,而机械缩足频率和自发缩足次数均减少（p＜0.05）。活体成像结果显示FER-1不影响肿瘤的生长（p＞0.05,BF VS BV）。蛋白印迹法结果提示:BV组与SV组相比,小鼠脊髓GPX4、和GABA表达显著下调（p＜0.05）而4-HNE和p-ERK表达上调（p＜0.05）;与BV组相比,BF组GPX4和GABA表达上调（p＜0.05）而4-HNE和p-ERK表达下调（p＜0.05）。免疫荧光结果显示,与SV组相比,BV组手术侧脊髓GABA分布减少（p＜0.05）;而BF组较BV组脊髓GABA分布增加（p＜0.05）。免疫电镜显示BV组GABA能神经元线粒体收缩和双膜密度较SV组明显;与BV组相比,BF组中铁死亡特征的GABA神经元数量减少。3.溶媒组中,与注射NS相比,注射帕瑞昔布后的小鼠机械痛阈、热痛阈值、机械缩足频率和10分钟内自发性缩足次数无显著差异（p＞0.05）;抑制剂组中,与注射NS相比,注射帕瑞昔布后的小鼠机械痛和热痛阈值增加（p＜0.05）,同时机械缩足频率（p＜0.05）和10分钟内自发性缩足次数显著减少（p＜0.01）。结论:1.小鼠骨肿瘤可导致脊髓GABA能神经元铁死亡并诱发痛觉过敏2.使用铁死亡抑制剂可以通过抑制GABA能神经元铁死亡缓解骨癌痛。3.抑制GABA能神经元铁死亡后可以增强帕瑞昔布在晚期骨癌痛小鼠中的镇痛作用。图12幅,参考文献73篇