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禽流感是由禽流感病毒引发的一种禽类间传染的传染性疾病。AIV的主要保护性抗原为血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA),对于免疫保护、AIV的包装和释放中起到了至关主要的作用。疫苗接种能有效的预防禽流感。其中DNA疫苗是最有潜力的基因工程疫苗之一,肌肉注射是其常用的免疫接种途径,具有给药剂量大、目的基因免疫原性较弱、蛋白表达水平低等缺陷,同时肌注给药导致绝大多数质粒DNA在未转运至抗原提呈细胞(APCs)前降解,生物利用度大大降低。目前,纳米材料作为非病毒载体,具有较好的生物降解性、生物相容性和黏膜吸附性及独特的理化性质,如易于加工修饰、表面性质可控、促进功能分子入胞、保护DNA和蛋白质等免受降解,其在疫苗佐剂和药物递送载体研究领域成为了关注的热点。本试验用含优化的H9N2亚型禽流感病毒HA基因片段、H5N1亚型禽流感病毒HA基因片段和NA基因片段构建了6个含单基因或多基因的禽流感病毒HA和NA基因的真核表达质粒pβH5、pβH5SH9、pSH9、pβH9、pβH9N1、pβH9N1SH5,并以通过动物试验筛选到的免疫效果好的质粒pβH9N1SH5为模型抗原、多聚赖氨酸树状高分子(DGL)为递送载体,通过静电吸附作用制备了能够同时表达H9N2亚型AIV的HA蛋白及H5N1亚型AIV的HA和NA蛋白的纳米DNA疫苗(pβH9N1SH5/DGL-NPs),并对pβH9N1SH5/DGL-NPs理化特性、稳定性、转染效率、免疫效果等进行了较为详细的研究。试验结果表明:1、构建了6种含单基因或多基因的禽流感病毒HA基因和NA基因真核表达质粒pβH5、pβH5SH9、pSH9、pβH9、pβH9N1、pβH9N1SH5;2、SPF鸡免疫试验结果表明,插入三个基因片段的质粒pβH9N1SH5免疫效果明显优于插入一个或两个基因片段的质粒DNA。同时,小鼠免疫接种试验结果也表明了真核表达质粒pβH9N1SH5的免疫效果最佳;3、DGL细胞毒性评价试验结果表明,DGL毒性小,可以作为质粒pβH9N1SH5递送载体;4、制备的pβH9N1SH5/DGL-NPs形态规则、外形圆整、分散系数小,平均粒径为(119.33±0.93)nm,Zeta电位为(44±2.26)mV,包封率为(93.1±1.5)%,载药量为(23.3±0.38)%;5、体外抗DNase I降解试验结果表明,DGL能够保护质粒pβH9N1SH5免受DNase I降解;6、体外释放试验结果表明,pβH9N1SH5/DGL-NPs中质粒pβH9N1SH5的释放是先突释,然后是平稳的缓慢释放,一直持续到216h;7、体外表达试验结果表明,DGL包裹质粒pβH9N1SH5后,质粒pβH9N1SH5生物活性保持良好,能够获得表达;8、动物体内试验结果表明,肌注免疫pβH9N1SH5/DGL-NPs组小鼠体内IgG抗体水平高于质粒pβH9N1SH5组,使机体产生了较强的体液免疫应答;同时,肌注免疫pβH9N1SH5/DGL-NPs组IFN-γ、IL-2分泌量和脾淋巴细胞转化率均有明显变化,T淋巴细胞大量增殖,CD3+CD8+和CD8+/CD4+在初免后第三周迅速上升,使机体产生了较强的细胞免疫应答。本研究构建了表达单基因或多基因真核表达质粒,经动物实验筛选免疫效果好的质粒DNA,将其与纳米材料DGL连接,制备了禽流感DGL纳米DNA疫苗,为开发新型禽流感疫苗或改进现有疫苗及疫苗缓释提供了可借鉴的研究思路与方法。