【摘 要】
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目的:构建肝癌干细胞富集裸鼠模型,并结合单细胞转录组测序技术初步探讨肝癌干细胞的异质性。方法:1.预选取14株细胞株选取皮下成瘤能力最强的2种肝癌细胞株HCC-LM3,MHCC-97L,通过细胞株皮下种植成瘤后取出瘤体制成单细胞悬液,根据皮下种植次数命名细胞株,将未进行皮下种植成瘤的细胞株命名为原代细胞株,进行过一次皮下种植成瘤消化出的细胞命名为一代细胞株,并以此类推。通过体内和体外实验对比原代及
【基金项目】
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项目名称:基于单细胞质谱流式技术研究双表型肝细胞癌肿瘤干细胞和免疫微环境特征，项目合同编号:8196100941，项目来源:国家自然科学基金，项目起止时间:2020.01-2023.12； 项目名称:肝癌的三维基因组学，项目合同编号:2016GXNSFGA380006，项目来源:广西自然科学基金创新团队，项目起止时间:2016.09-2020.12；
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目的:构建肝癌干细胞富集裸鼠模型,并结合单细胞转录组测序技术初步探讨肝癌干细胞的异质性。方法:1.预选取14株细胞株选取皮下成瘤能力最强的2种肝癌细胞株HCC-LM3,MHCC-97L,通过细胞株皮下种植成瘤后取出瘤体制成单细胞悬液,根据皮下种植次数命名细胞株,将未进行皮下种植成瘤的细胞株命名为原代细胞株,进行过一次皮下种植成瘤消化出的细胞命名为一代细胞株,并以此类推。通过体内和体外实验对比原代及一代细胞株干性强弱,验证干细胞富集裸鼠模型是否构建成功。取对数期生长的两种细胞原代细胞株及一代细胞株进行体内实验,皮下种植成瘤后21天处死裸鼠,测量肿瘤长短径并称重。比较处理前后细胞株成瘤能力。体外实验选取HCC-LM3原代及一代细胞株干细胞成球实验,观察两组细胞干细胞球形态并比较。CCK-8检测法比较两组细胞株增殖能力,细胞凋亡流式检测比较两组细胞株抗凋亡能力,细胞划痕实验比较两组细胞株迁移能力,上述实验辅助支持两组细胞干性强弱的比较。2.将HCC-LM3,MHCC-97L细胞的原代及一代细胞株进行单细胞转录组测序,构建测序文库,库检合格以后,测序平台进行测序。数据质控后进行归一化和可视化处理,筛选高变基因进行分群,通过Cell Marker查询各个亚群差异表达基因的对应细胞群,并对每个亚群做GO-KEGG差异基因富集分析,识别各个亚群的特征。挑选出肝癌干细胞亚群及其富集的基因和通路。结果:通过皮下种植成瘤成瘤实验筛选出两株成瘤最强的肝癌细胞株HCC-LM3,MHCC-97L;HCC-LM3,MHCC-97L细胞的原代及一代细胞株裸鼠皮下成瘤实验结果显示HCC-LM3原代组肿瘤大小为（895.8±105.6 mm3）vs HCC-LM3一代组（2370.5±394.5 mm3）,p＜0.001;HCC-97L原代组肿瘤大小为（858.8±69.1mm3）vs HCC-97L一代组（1596.5±193.5 mm3）,p＜0.001;一代细胞表现出比强于原代细胞的成瘤能力;细胞成球实验观察数量及成球形态大小上,HCC-LM3一代细胞株都远高于HCC-LM3原代细胞株。CCK8法结果OD值在24h,48h,72h时HCC-LM3一代细胞表现出了高于HCC-LM3原代细胞的增殖能力且具有显著性。细胞凋亡流式检测结果HCC-LM3原代和HCC-LM3一代细胞的凋亡率分别为11.35%和5.63%,p＜0.001。HCC-LM3一代细胞表现出了高于HCC-LM3原代细胞的抗凋亡能力。细胞划痕实验结果显示HCC-LM3一代细胞在24h时愈合趋势明显,划痕空白面积明显缩小。相较于HCC-LM3原代细胞表现出明显优越的迁移能力。综上结果支持在一代细胞株相较原代细胞株产生了干细胞富集的变化。证实通过连续原位种植细胞株成功构建了干细胞富集的裸鼠模型。单细胞转录组测序结果根据高变基因分出10个亚群,肝癌干细胞亚群为亚群2及亚群6,其中KRT19（CK19）,SOX9,ICAM1（CD54）,CD47肿瘤干细胞标志物基因在亚群2被高表达,ANPEP（CD13）,CD44肿瘤干细胞标志物基因在亚群6被高表达,PI3K/Akt、TNF-α等信号通路也随着肝癌干细胞的富集被激活。结论:运用连续皮下种植细胞株成功构建了肝癌细胞干性富集裸鼠模型;筛选出了在细胞株成瘤组织中的干细胞亚群2及亚群6,其中KRT19（CK19）,SOX9,ICAM1（CD54）,CD47肿瘤干细胞标志物基因在亚群2被高表达,ANPEP（CD13）,CD44肿瘤干细胞标志物基因在亚群6被高表达;PI3K/Akt、TNF-α等信号通路对肝癌干细胞富集可能发挥着主要调控作用。
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