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新型鸭呼肠孤病毒（Novel duck reovirus,NDRV）病是一种以脾脏肿大、出血及坏死为特征性病变的传染病,死亡率5～15%,耐过鸭群生长发育受阻,成为僵鸭,给国内水禽养殖业带来极大的危害。本研究从患病鸭脾脏中分离得到一株NDRV,将其命名为TL株。针对TL S1基因成功建立了荧光定量RT-PCR检测方法,并利用该方法对不同感染时期的雏鸭进行该病毒在不同组织器官中的分布、排毒规律及血清和脾脏炎性细胞因子分泌表达量进行监测,主要研究内容及结果如下:1.NDRV的分离鉴定:采集疑似NDRV感染的病死雏鸭脾脏,经RT-PCR检测后,挑选检测为阳性的病料进行无菌处理,并接种于9～11日龄鸭胚尿囊腔连续传代培养,进行病毒分离培养。培养至第F 8时,85%鸭胚死亡时间集中60～120h,感染鸭胚呈规律性死亡,胚体有发育迟缓、水肿、出血等病变。对F8代尿囊液进行NDRV RT-PCR检测,检测结果为阳性并将其命名为TL株;将TL株S1基因的核苷酸序列与NDRV、ARV、MDRV进行同源性分析,结果表明TL株的S1基因与其他NDRV毒株的同源性较高,与SD19株的S1基因的同源性为100%,表明TL毒株属于NDRV。利用RT-PCR方法对分TL株进行纯净性检测,判定是否含有DHV、AIV、MDRV、TMUV、ARV、DPV和FAd V等常见鸭病病原,除NDRV为阳性外其余结果均为阴性,表明该毒株不含其他常见鸭病病原。测定TL株的致病力,利用Reed-Muench法计算出雏鸭半数致死量为1×10-4.55LD50/0.2 m L。人工感染雏鸭出现与自然感染病例相似的临床症状及剖解病变。上述试验结果表明该分离毒株为脾坏死性NDRV。2.NDRV荧光定量RT-PCR检测方法的建立:根据TL株S1基因设计合成一对特异性引物,构建阳性质粒标准品,建立荧光定量RT-PCR检测方法。根据TL S1基因的质粒拷贝数与定量反应Ct值的关系,绘制标准曲线,并就敏感性、特异性及临床样本检测与常规RT-PCR比较。结果表明:该方法的标准曲线在1.0×10~1～1.0×10~6拷贝/μL之间具有良好的线性关系,线性回归方程为y=-3.423+34.279,斜率为-3.4,相关系数R2为0.9978;敏感性良好,最小检出模板浓度为15copies/μL,是常规RT-PCR的1000倍;特异性良好,除NDRV外,DTMUV、DHV、MDRV、EDSV、NDV、DPV及RA的检测结果均为阴性;组间和组内变异系数均在2.0%以下,稳定性和重复性良好;200份临床样品检测,常规RT-PCR检出阳性样品40份,阳性检出率为20.00%,此方法检出阳性样品47份,阳性检出性率为23.50%,荧光定量RT-PCR检测结果与常规RT-PCR方法检测的病原结果符合率为96.5%。本研究成功建立了基于SYBR Green I的一种特异性强、灵敏度高、稳定性好的荧光定量RT-PCR检测方法。3.NDRV致病性研究:纯化的尿囊液接种1日龄健康雏鸭,观察记录雏鸭感染后的主要临床症状及体重增长变化情况;样本采集点设定为感染后1 d、3 d、6 d、9 d、12 d、15 d、18 d、21 d、24 d、27 d和30 d,在每个样本采集节点每组随机抽取3只剖杀,采集各组泄殖腔棉拭子和抗凝血3份,检测雏鸭的排毒情况及病毒血症情况,观察眼观病变及将组织器官制备石蜡切片,观察其组织病理学变化;同时收取各组织器官进行病毒载量的测定;并对不同感染时期的雏鸭血清、脾进行IL-2、IL-6、IL-4、IL-10、TNF-α及IFN-γ的荧光定量RT-PCR和ELISA检测。结果显示:3～15日龄为其发病高峰期,感染率100%,死亡率18.18%;临床症状主要表现为拉黄色、白色稀粪,偶见角弓反张;试验组雏鸭体重增长缓慢,试验结束时,对照组体重是试验组的两倍左右;脾脏先后出现肿大、出血、坏死、质地变硬等一系列眼观病变;病理组织学观察显示:脾脏白髓萎缩、淋巴细胞坏死;法氏囊小结与黏膜间距增宽;胸腺髓质淋巴细胞坏死;血液排毒规律监测结果显示:接种后24 h即可在血液中检测到病毒的存在,第6 d为排毒高峰期,接种后18 d未检测到该病毒的存在;泄殖腔排毒监测结果显示:雏鸭接种NDRV尿囊液后,24 h即可在泄殖腔棉拭子中检测到病毒存在,第6 d为泄殖腔棉拭子排毒高峰期。组织病毒载量结果显示,人工接种TL株后,24 d时即可在心、肝、脾、肺、肾、胰、胃、法氏囊、胸腺及脑检测到病毒的存在,表明NDRV具有广泛的组织嗜性。其中,以脾脏、法氏囊、胸腺中病毒载量较高,于接种后3 d达到排毒高峰,并在12～15 d时处于较低水平,随后在18～21 d时又出现小的排毒高峰可作为检测该病的优选器官;而胰腺、心、肝、肺、脑及腺胃中病毒载量相对较低;炎性因子检测结果显示:通过荧光定量及ELISA检测发现脾脏中的IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α及IFN-γ分泌表达量均上调,表明NDRV感染雏鸭后促进IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α及IFN-γ的分泌表达量。