民猪MyoG基因的克隆、表达与启动子核心区的定位

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骨骼肌的生长和分化具有十分复杂的机理,仔猪出生时所具有的肌纤维数量将决定个体的最大瘦肉生长潜力。在单位面积上肌纤维直经与肉质口感呈负相关,与产肉量呈正相关,所以肌纤维的生长发育状况与肉质有直接的联系。肌细胞生成素(Myogenin, MyoG)通过对成肌细胞的起始融合和肌纤维细胞的形成进行调控,在肌肉分化中起着重要的作用。民猪是我国优良的地方品种之一,具有高繁殖力、肉质好、耐粗饲、抗逆强等优点。但与引进猪种相比,瘦肉率较低。本实验采用分子生物学方法对民猪的MyoG基因进行了研究,以期为研究民猪骨骼肌的分化机制提供理论基础。首先采用RT-PCR方法克隆了民猪MyoG基因的全长编码区序列,利用生物学软件对其二级结构和三级结构进行了预测与分析,并利用双酶切和连接的方法构建了真核表达载体;然后采用RT-PCR的方法分析了MyoG基因在30日龄民猪各组织中的表达情况;最后通过双荧光素酶报告系统对MyoG基因启动子区的核心序列进行了检测与分析。获得的主要研究结果如下:1)获得了民猪MyoG基因675bp的全长编码区序列,与NCBI上已提交的其他猪种的MyoG基因序列比对后发现一个突变位点:391T→C,该突变引起了氨基酸序列的改变131C→R。2)成功构建了pcDNA3.1(+)-MyoG真核表达载体。3)获得了MyoG基因组织表达特异性结果,即MyoG基因只在骨骼肌组织中表达,在心脏,肝脏,脾脏,肺,肾脏,大肠,小肠,胃,卵巢组织中均不表达。4)获得了民猪MyoG基因5’侧翼及部分编码区在内的2203bp序列,与NCBI上已提交的序列相似度达到99%。5)成功构建了猪骨骼肌卫星细胞体外培养体系,且在细胞RNA中检测到了MyoG mRNA,说明MyoG基因在猪骨骼肌卫星细胞中表达。6)成功构建了9个序列缺失MyoG基因启动子区的荧光素酶报告基因载体,在骨骼肌卫星细胞中,利用双荧光素酶报告基因检测系统对其活性进行检测,发现在MyoG基因启动子区-1385bp~-1184bp存在调控元件,而启动子核心区域处于启动区-199bp~-31bp处。7)针对启动子区-199bp--31bp再次构建4个缺失不同DNA片段的荧光素酶载体,经双荧光报告系统检测和生物信息学分析发现,在-137bp~-101bp区域含有CdxA转录因子和MZF1转录因子,推测CdxA转录因子和MZF1转录因子在MyoG基因表达中起到重要的调控作用。
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