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卤醇脱卤酶能够在温和条件下催化邻卤醇脱卤和环氧化物的开环,在手性环氧化物和β-取代醇的合成方面具有极大的应用潜力。但是到目前为止立体选择性优异的卤醇脱卤酶仅有HheC,为了满足应用的需求,开发新型高效、选择性好、活性高的生物催化剂,已经成为卤醇脱卤酶工业应用基础研究的重点研究方向。本文首先以HheC和HheB为基因探针,通过基因挖掘法获得了10种潜在的卤醇脱卤酶基因,其中9种在大肠杆菌中成功表达。以苯基缩水甘油醚（（R,S）-PGE）为模式底物,通过显色反应和高效液相色谱检测比较,筛选获得3种高活性且具有不同选择性的卤醇脱卤酶;经引入组氨酸标签后,确定了一种来源于菌株Pseudomonas pohangensis的HHDHHis10作为后续研究对象,其与HheB的同源性为44%,与HheC的同源性为31%,并对（R,S）-PGE表现出R选择性。通过Ni-NTA柱纯化目标蛋白,并对其酶学性质进行研究。其最适脱卤反应温度为40℃,最适脱卤反应pH为10.0,最适开环反应pH为7.5,该酶在pH6.0-7.5范围内和温度低于50℃时具有较好的稳定性。HHDHHis10具有较广的底物谱,对多种卤代醇和环氧化物表现出较好的活性及对映选择性。该酶对底物（R,S）-PGE的Km为31.75 mM,Vmax为32.79μmol·min-1·mg-1。HHDHHis10对（R,S）-PGE表现出较好的对映选择性,在20 mM的底物浓度下,获得的（S）-PGE的ee值和收率分别为>99%和16.35%;在pH 7.5和pH 8.0条件下,HHDHHis10催化拆分1-氯-3-苯氧基-2-丙醇（7）的单酶串联反应中,获得的（R）-7的ee值均可达>99%,收率约为25%。为提高酶的立体选择性,尝试对酶进行半理性设计改造,利用同源建模和分子对接技术,选定底物结合口袋附近的6个氨基酸残基（Gln159、Asn160、Phe161、Tyr167、Phe168和Pro169）进行定点饱和突变和组合突变。以（R,S）-PGE为模式底物,通过高效液相色谱检测,获得3个立体选择性提高的突变体,分别是Q159L、N160L和P169Q,其对映体选择率分别约从9.85提高到21.80,21.10和10.84,其中突变体N160L的选择性和原始酶是相反的。我们还尝试对突变体进行叠加突变,但是并未检测到选择性提高的阳性突变体。利用亲和层析分离纯化突变体N160L和Q159L,结果发现突变后的酶活相比较于原始HHDHHis10明显降低,分别为原始酶的56.75%和47.45%。通过对突变体N160L与Q159L的环氧化物底物谱进行研究,两突变体除了对底物邻乙基苯基缩水甘油醚（12）和苯基环氧乙烷（16）选择性没有提高以外,对于其它底物的选择性均有一定程度的提高,尤其是突变体N160L对底物对甲基苯基缩水甘油醚（11）的E值提高到了25.77,是原始HHDHHis10的13.93倍。对突变体N160L与原始HHDHHis10对映选择性相反的机理进行分析,结果表明:通过将突变体N160L与（R）-PGE和（S）-PGE分子对接发现,两个氨基酸残基Ser116和Tyr129与（R）-PGE和（S）-PGE底物的氧原子之间形成的氢键的距离不同,导致发生作用的作用力存在差异,从而出现了构型逆转的现象。利用突变体N160L动力学拆分（R,S）-PGE（20-200 mM）,获得（R）-PGE的最大ee值可达>99%,收率最高达到30.92%。