[研究背景和目的]抑郁症是目前严重危害人类健康的精神疾病,其发病率明显攀升,大约影响全球20%的人口。世界卫生组织预测,到2020年,抑郁症将成为全球残疾负担的第二大原因。抑郁症的病因尚不完全清楚,一般认为抑郁症的发病主要与单胺类神经递质缺乏、下丘脑-垂体-肾上腺(hypothalamic-pituitary- adrenal, HPA)轴功能失调、神经营养因子减少、细胞因子异常等因素有关。目前抑郁症的治疗并不理想,普遍使用的基于单胺神经递质缺乏假说的药物只能使不超过50%的患者完全缓解,因此寻找新的有效的抗抑郁药物己成为抑郁症研究的当务之急。近二十年来,对抑郁症的研究提出“细胞因子假说”,认为炎症过程和脑-免疫相互作用在抑郁症中占重要地位,细胞因子在抑郁症的发病机制中起重要的作用。抑郁症常伴有免疫系统的激活,细胞因子分泌增多,相反,细胞因子也可以引起个体情绪和行为的改变。在抑郁症中,促炎性细胞因子与抗炎性细胞因子的激活共同发生,促炎性细胞因子如白介素(interleukin, IL)1、IL-6、IL-17和肿瘤坏死因子α (tumor necrosis factor-α, TNF-α)等参与免疫激活和炎症的发生,而抗炎性细胞因子如IL-10和IL-13等,通过抵抗细胞激活和炎性调节子的产生抵抗免疫应答。研究证实,氧化应激过程在抑郁症的发病机制中发挥重要的作用,抑郁症与体内氧化应激增加以及内源性抗氧化物质的浓度降低有关。机体内的氧化应激损伤主要源自活性氧(reactive oxygen species, ROS), ROS己被证明可调节去甲肾上腺素、5-羟色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)、多巴胺和谷氨酸的水平和活性,而上述神经递质皆参与抑郁症的发病过程。抑郁症患者内源性抗氧化物质的浓度和活性的降低,如抗氧化酶超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、过氧化氢酶(catalase, CAT)以及谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)等。HPA轴功能失调与抑郁症的发病密切相关。抑郁症患者HPA轴调节功能受损,血浆皮质醇和脑脊液促肾上腺皮质激素释放激素(corticotropin-releasing hormone, CRH)水平皆升高。长期给予外源性的糖皮质激素可增加大鼠的抑郁行为；糖皮质激素受体敲除小鼠HPA轴活性增高,抑郁行为增加。脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)是一种神经营养肽,对轴突生长、神经元存活和突触可塑性至关重要。BDNF与抑郁症的发病机制密切相关。动物实验与临床研究结果都表明抑郁个体BDNF水平下降,而抗抑郁药治疗可以恢复BDNF水平；研究也表明BDNF水平与5-HT呈正相关。此外,在大鼠抑郁模型,中枢给予BDNF可产生抗抑郁样活性,这直接支持了BDNF对抑郁症的保护作用。此外,有证据表明炎症因子能降低人体的BDNF水平,这表明炎症和BDNF在抑郁症中起重要作用。银杏叶提取物(Ginkgo biloba extract, EGb761)具有抗炎、抗氧化、抗动脉硬化的和神经保护作用。有国外的动物试验表明,EGb761预处理显著降低BALB/c小鼠强迫游泳实验的不动时间,具有改善抑郁症状的作用。动物模型是研究抑郁症的发病机理、筛选药物和治疗策略的重要工具,脂多糖(lipopoly-saccharides, LPS)诱导模型是公认的炎症相关的抑郁症动物模型。EGb761是否对LPS诱导的抑郁症模型具有抗抑郁样作用还未可知。本研究通过单次和重复间歇腹腔注射LPS的方法,制备急、慢性抑郁样行为小鼠模型,通过EGb761预处理和治疗,观察小鼠行为学改变,对比炎性因子、BDNF、氧化应激及皮质酮表达水平干预前后的变化,初步明确EGb761抗抑郁作用,进一步探讨该药的抗抑郁机理,为EGb761应用于抑郁症的治疗提供理论依据。[方法]1.动物模型的建立与评估(1)急性抑郁样行为小鼠模型选用C57BL/6J雄性小鼠,腹腔内单次注射LPS,剂量为830 μg/kg,应用强迫游泳实验、悬尾实验、蔗糖偏好实验和旷场实验评估小鼠抑郁样行为的形成。(2)慢性抑郁样行为小鼠模型选用C57BL/6J雌性小鼠,每月相同5天连续腹腔注射LPS,剂量依次是：750μg/kg、1000μg/kg、1250μg/kg、1000μg/kg、750μg/kg,连续注射4个月,应用强迫游泳实验、悬尾实验、蔗糖偏好实验评估小鼠抑郁样行为的形成。2.实验分组与实验过程(1)EGb761预处理对急性抑郁样行为小鼠行为学的影响与机制40只C57BL/6J雄性小鼠随机分为对照组、模型组、EGb761低剂量组、EGb761中剂量组和EGb761高剂量组,每组8只。从实验第1天至12天,EGb761低、中、高剂量组小鼠分别给予EGb761 50 mg/kg/day、100 mg/kg/day和150mg/kg/day(生理盐水溶解)灌胃,对照组和模型组小鼠给予等量生理盐水；经过10天预处理,模型组、EGb761低、中、高剂量组小鼠均腹膜内注射LPS,剂量为830 μg/kg,小鼠腹腔注射LPS 24h后,采用旷场试验评估EGb761对小鼠的自发活动的影响,采用强迫游泳实验、悬尾实验和蔗糖偏好实验评价EGb761对小鼠抑郁样行为的影响。行为学评价完成后,小鼠麻醉处死,取大脑组织,在冰上剥离出海马,用匀浆器制成匀浆,4-C、5000 rpm离心15 min,上清液分装后,-20℃保存。ELISA测定小鼠海马组织炎性细胞因子和BDNF水平。(2)EGb761治疗对慢性抑郁样行为小鼠行为学的影响与机制40只C57BL/6J雌性小鼠随机分为对照组、模型组、EGb761低剂量组、EGb761中剂量组和EGb761高剂量组,每组8只；模型组、EGb761低、中、高剂量组小鼠每月相同5天连续腹腔注射LPS,剂量依次是：750 μg、1000μg/kg、 1250 μg/kg、1000μg/kg、750μg/kg,对照组腹腔注射等量生理盐水,连续注射4个月；造模完成后,EGb761低、中、高剂量组分别给予EGb761 50 mg/kg/day、 100 mg/kg/day和150 mg/kg/day(生理盐水溶解)灌胃1个月,对照组和模型组小鼠给予等量生理盐水。采用强迫游泳实验、悬尾实验和蔗糖偏好实验评价EGb761对小鼠慢性抑郁样行为的影响。行为学评价完成后,小鼠麻醉处死,取血静置后,4℃、3000rpm离心5min,取上清,-20℃保存。取大脑组织,在冰上剥离出海马,用匀浆器制成匀浆,4℃、5000 rpm离心15 min,上清液分装后,-20℃保存。ELISA法测定血清和海马组织炎性细胞因子水平；生物化学方法测试血清和海马组织丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、过氧化氢酶(catalase, CAT)以及谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)活力；荧光法测试血清皮质酮(corticosterone, CORT)含量。[结果]1.LPS诱导急性和慢性炎症致小鼠抑郁样行为与对照组相比,腹腔注射LPS可使小鼠FST和TST表现出明显延长的不动时间(P<0,05),而且小鼠蔗糖水偏嗜度显著降低(P<0.05),这说明单次和重复间歇腹腔注射LPS皆可诱导小鼠显著的抑郁样行为；在旷场实验中,急性抑郁模型组小鼠的水平得分和垂直得分均较对照组减少(P<0.05),这表明腹腔注射LPS可减少小鼠的自发活动。2.EGb761预处理对急性抑郁样行为小鼠的影响(1)改善急性抑郁样行为与模型组相比,EGb761中剂量组和高剂量组小鼠FST和TST的不动时间明显缩短(P<0.05),而且,EGb761高剂量组小鼠的不动时间短于EGb761低剂量组和中剂量组(P<0.05)蔗糖偏嗜实验中,EGb761中剂量组和高剂量组小鼠的蔗糖水偏嗜度要高于的模型组(P<0.05),EGb761高剂量组小鼠的蔗糖水偏嗜度要高于EGb761低剂量组(P<0.05)；以上结果表明,EGb761预处理对单次腹腔注射LPS诱导的抑郁样行为小鼠有抗抑郁作用,并且其作用呈剂量相关性。在旷场实验中,模型组、EGb761高剂量组、中剂量组和低剂量组之间小鼠的水平得分和垂直得分无显著差别(P>0.05),这提示EGb761预处理对小鼠的自发活动没有显著影响。(2)调节海马炎症细胞因子的产生与对照组相比,模型组小鼠海马促炎性细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-17A的浓度更高(P<0,05),而海马抗炎性细胞因子IL-10的浓度低于对照组(P<0.05),这表明腹腔注射LPS可诱导小鼠海马的炎症。然而,与模型组相比,预先给予中剂量和高剂量EGb761均显著抑制海马TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-17A水平的升高,同时升高IL-10的水平(P<0.05)；此外,高剂量EGb761的抗炎作用要强于EGb761低剂量和中剂量(P<0.05)(3)增加海马BDNF的水平与对照组相比,模型组小鼠海马BDNF的浓度低于对照组(P<0.05),然而,与模型组相比,预先给予中剂量和高剂量EGb761均显著升高海马BDNF的水平(P<0.05)；此外,高剂量EGb761的作用要强于EGb761低剂量和中剂量(P<0.05)。3.EGb761治疗对慢性抑郁样行为小鼠的影响(1)改善慢性抑郁样行为与模型组相比,EGb761中剂量组和高剂量组小鼠FST和TST的不动时间明显缩短(P<0.05),而且,EGb761高剂量组小鼠的不动时间短于EGb761低剂量组和中剂量组(P<0.05)。蔗糖偏嗜实验中,EGb761中剂量组和高剂量组小鼠的蔗糖水偏嗜度要高于的模型组(P<0.05), EGb761高剂量组小鼠的蔗糖水偏嗜度要高于EGb761低剂量组(P<0.05)；以上结果表明,EGb761治疗对重复间歇腹腔注射LPS诱导的慢性抑郁样小鼠有抗抑郁作用,并且其作用呈剂量相关性。(2)调节海马和血清炎症细胞因子的产生在小鼠海马,与对照组相比,模型组小鼠促炎性细胞因子TNF-α和IL-6的浓度更高(P<0.05),而海马抗炎性细胞因子IL-10的浓度低于对照组(P<0.05),这表明连续4个月重复、间歇LPS腹腔注射也可诱导小鼠海马的炎症。EGb761给药1个月后,与模型组相比,EGb761中剂量和高剂量组均显著抑制海马TNF-α和IL-6水平的升高以及IL-10水平的降低(P<0.05)。此外,高剂量EGb761的抗炎作用要强于EGb761低剂量和中剂量(P<0.05)在小鼠血清,TNF-α和IL-6的浓度在对照组、模型组、EGb761低、中、高剂量组之间无显著性差异(P>0.05)；模型组IL-10的浓度低于对照组(P<0.05),EGb761给药1个月后,中剂量和高剂量EGb761均显著使血清IL-10水平升高(P<0.05)。(3)降低海马和血清氧化应激水平与对照组相比,连续4个月重复、间歇LPS腹腔注射可显著升高模型组小鼠海马和血清的MDA含量(P<0.05),同时,海马和血清SOD、CAT和GSH-Px的活性下降(P<0.05)。 EGb761给药1个月后,低剂量组、中剂量组和高剂量组小鼠海马和血清的MDA含量均降低,与模型组相比差异显著(P<0.05)。此外,给予EGb761高剂量和中剂量治疗,可恢复小鼠海马和血清SOD、CAT和GSH-Px的活性,与模型组相比差异显著(P<0.05),并且EGb761高剂量的作用更强(P<0.05)。(4)降低血清CORT的浓度与对照组相比,连续4个月重复、间歇LPS腹腔注射可显著升高模型组小鼠血清CORT的浓度(P<0.05)。 EGb761给药1个月后,中剂量组和高剂量组小鼠血清CORT的浓度均降低,与模型组相比差异显著(P<0.05),此外,EGb761高剂量抑制小鼠血清CORT的作用更强(P<0.05)。[结论]1.单次和重复间歇腹腔注射LPS均可诱导C57BL/6J小鼠显著的抑郁样行为,重复间隔LPS给药诱导的抑郁样行为持续时间更长。2.EGb761预处理可显著减轻单次腹腔注射LPS小鼠的急性抑郁样行为,并且其作用呈剂量相关性；同时,EGb761预处理可抑制小鼠海马促炎性细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-17A的产生,并能恢复小鼠海马BDNF和抗炎性细胞因子IL-10的水平；EGb761抗抑郁作用与其抑制海马的炎症相关。3.EGb761治疗可减轻重复间歇腹腔注射LPS小鼠的慢性抑郁样行为,并且其作用呈剂量相关性；同时,EGb761治疗可抑制小鼠海马TNF-α、IL-6以及海马和血清MDA的产生,恢复海马和血清IL-10的水平以及SOD、CAT、GSH-Px的活性,并抑制血清CORT水平的升高。4.EGb761抗抑郁作用涉及多个信号通路,包括抑制炎症过程、增加BDNF表达、调节氧化应激和恢复HPA轴的功能。