本协作研究小组成员在构建正常成人主动脉和心脏cDNA文库并进行大规模ESTs(Expressed Sequence Tags)测序的基础上,在1号染色体短臂3区(lp31.1)发现了一个可能与细胞骨架调节信号传导通路相关的新基因。在前期的研究中1、酵母双杂交结果表明它能与心肌肌钙蛋白I(cardiac troponin I,cTnI)、心肌肌动蛋白(α-actin)等一系列肌小节收缩调节蛋白发生作用,故而正式命名为TNNI3K(cTnI-interacting kinase);2、Northern Blot和多组织点阵杂交表明它只在心脏部位特异性表达;3、体外激酶活性分析显示它是具有功能活性的有丝分裂原激活蛋白激酶激酶激酶(MAPKKK);4、被Manning编录的人类蛋白激酶基因组收录,在其绘制的系统进化树(www.kinase.com/human/ kinome)中,TNNI3K(原称HH498)的序列号为SK494,体现了对这一基因鉴定工作的充分肯定。作为一个新认识的心脏特异性表达的新激酶家族成员,其调节底物、作用机制、以及对病理条件下心血管系统产生的生物学功能及其有关信号传导通路都还不清楚。为深化上述研究思路,本课题设计通过细胞分子学(腺病毒载体基因转导原代培养心肌细胞)、动物实验(基因修饰干细胞治疗)及临床患者(缺血性心脏病血清学检查)三个层面,从分子生物学的微观改变和病理生理、组织结构功能及生化指标的宏观变化,多角度探讨TNNI3K在心肌缺氧/缺血损伤时的意义,以深入了解这一新的激酶的功能作用及可能机制。该课题所做工作为源头创新,国内外未有报道。第一部分:TNNI3K对缺氧所致心肌损伤的影响及可能机制目的:利用体外培养心肌细胞并结合缺氧造成损伤模型,观察不同缺氧时间段(0h、3h、6h、12h、24h)TNNI3K水平的变化;进而利用腺病毒转导心肌细胞使得TNNI3K基因高表达,从而研究该基因对缺氧造成心肌损伤的影响,并探讨产生作用的有关信号转导通路。方法:新生乳鼠原代心室肌细胞由胰酶消化法获得,缺氧环境在密闭的AnaeroPack方盒(Mitsubishi Gas Chemical Co, Inc)中经一次性缺氧催化袋GENbox anaer (BioMérieux?sa, France)(它能吸收O2 ,产生CO2)产生。实验分三个部分1、观察本实验设计的缺氧模型/无血清培养0h、3h、6h、12h、24h五个时间点心肌细胞损伤的情况:倒置显微镜下观测各组心肌细胞搏动的频率和节律,全自动生化分析仪测定心肌细胞培养液乳酸脱氢酶(LDH)活性,以确立损伤模型的建立;Western blot法半定量TNNI3K基因的表达,明确缺氧损伤对TNNI3K基因的表达是否具有影响,这是确立整篇研究的基础。2、腺病毒载体TNNI3K基因转导在缺氧/无血清干预造成原代大鼠心肌细胞损伤中的作用。用本组前期包装和扩增的绿色荧光蛋白(GFP)标记Ad-TNNI3K(携带TNNI3K基因的腺病毒)、Ad- TNNI3K-AS(携带反义TNNI3K基因腺病毒)和Ad-C(Ad-LacZ,即空载体腺病毒)瞬时转导原代培养心肌细胞,观察TNNI3K基因对缺氧导致的细胞病理损伤包括LDH活性、心肌细胞搏动的频率和节律、细胞存活率(MTT法)等的影响,并用Hoechst 33258染色和DeadEndTM Colorimetric TUNEL System检测各组细胞凋亡及凋亡指数。3、探讨TNNI3K基因高表达抗缺氧/无血清诱导心肌细胞损伤或凋亡的机制。用Western blot法半定量磷酸化细胞外信号调节激酶C(phosphorylated extracellular signal-related kinases, p-ERK)、c-jun氨基末端激酶(phosphorylated c-Jun N- terminal kinases,p-JNK)和p38(p- p38)激酶的表达,观察MAPK信号通路中三条主要途径的参与作用;同时,选择缺氧12h为观察时间点,用酶标仪法测Caspase-3活性,免疫细胞化学和激光共聚焦显微镜检测不同组别缺氧前后细胞色素C在细胞胞浆和线粒体中的定位改变,Rhodamine 123染色流式细胞仪测定线粒体膜电位,以及Western blot法半定量致凋亡蛋白Bax的表达,共同阐述TNNI3K基因对线粒体信号通路的作用。结果:1、利用AnaeroPack缺氧盒,配合无血清DMEM培养成功建立缺氧模型,缺氧0.5h后,细胞培养液中的氧分压达40mmHg以下,氧饱和度20%左右,达到缺氧实验所要求的标准。缺氧6h可见心肌细胞搏动频率减慢,节律出现不规整,至缺氧24h绝大多数细胞已无搏动,极少数浅慢搏动;培养液LDH水平在缺氧6h以后即有显著性升高(P<0.05),24h更甚(P<0.01),提示细胞出现损伤性改变;同时TNNI3K蛋白表达在缺氧早期(3h)即上调,12h达到高峰,24h后渐回落,提示TNNI3K在心肌细胞缺氧应激时可能发挥作用。2、利用腺病毒作为载体,成功转导原代心肌细胞,缺氧可使心肌细胞存活率下降,但在12h和24h时Ad-TNNI3K、Ad-TNNI3K-AS两组的细胞生存率优于Ad-C组,前两组之间无显著性差异;缺氧12h后,Ad-C、Ad-TNNI3K、Ad-TNNI3K-AS三组均见LDH升高,而Ad-TNNI3K组要明显低于Ad-C、Ad-TNNI3K-AS两组,后两组之间比较,Ad-TNNI3K-AS组又明显低于Ad- C,表明TNNI3K高表达对细胞的保护作用;同时,Hoechst 33258染色和TUNEL检测显示,Ad- TNNI3K基因高表达能使缺氧12和24h的凋亡指数均低于Ad-C组,提示TNNI3K基因具有抗细胞凋亡的作用。由于反义TNNI3K组的作用介于TNNI3K和Ad-C组之间,有时和TNNI3K组无明显差异,推测反义TNNI3K未能抑制大鼠心室肌细胞内TNNI3K同源基因的表达,一方面可能是因为种属差异,另一方面,可能是由于反义核酸技术本身存在作用的不可预知性的问题,故在有关机制的研究中只对Ad-C组和Ad- TNNI3K两组进行了分析。3、对TNNI3K产生作用的机制研究表明,(1)MAPK信号通路中,缺氧前Ad-C组和Ad- TNNI3K两组心肌细胞即有较低水平的ERK1/2和JNK磷酸化,两组之间无显著差异。缺氧3h后,Ad-C组p-ERK1/2表达水平明显升高,持续到6h,而Ad-TNNI3K组改变不明显,两组间比较显见不同(p<0.05);但到12h、24h则两组均趋于下降,组间差异不明显。p-JNK与上述不一样,Ad-C组在缺氧3h时一度轻度上升,但随即处于极低表达状态,Ad- TNNI3K组则升高更加明显,且高峰持续至缺氧12h,于6h和12h两个时间点两组差别极显著(P<0.01),至24h时两组均处于很低水平。而反复行western blot实验,在38KD附近检测到的杂交信号非常弱,无法判别所需的目的条带,推测在本研究设计的缺氧干预腺病毒转导心肌细胞中,p38蛋白基本没有被磷酸化,或磷酸化的水平很低。(2)高表达TNNI3K基因能够抑制缺氧各时间点Caspase-3的激活程度,至缺氧12h、24h差异显著;能明显减轻由缺氧12小时导致的细胞色素C从线粒体到胞浆的释放水平,抑制凋亡蛋白Bax的表达;提示TNNI3K基因的抗凋亡作用通过线粒体信号途径。结论:在体外培养的原代心肌细胞实验中,首次证明心脏特异性表达的新激酶基因TNNI3K具有抗缺氧造成的细胞损伤和凋亡作用。抑制MAPK级联信号通路中ERK1/2的早期、瞬间磷酸化激活以及提高JNK1/2的磷酸化水平;同时,抑制线粒体信号途径中Caspase-3的激活和细胞色素C的释放,以及凋亡蛋白Bax的表达是其发挥抗凋亡作用的机制。第二部分:心外膜心肌注射TNNI3K对心肌梗死后兔心功能的影响目的:观察整体动物急性心肌梗死后,通过使局部高表达TNNI3K,能否改善心肌重塑而达到减轻心功能损害。方法:P19CL6细胞是鼠科胚胎瘤(embryonal carcinoma,EC)P19细胞的衍生物,P19细胞是一种来源于鼠科畸胎瘤的未分化干细胞,P19CL6细胞形态上与之相似,但不表达特异性的EC标记物SSEA-1抗原,已经证实在加入DMSO作为诱导剂的培养基中,它能有效分化成表达心脏特异基因的搏动的心肌细胞,同时具有心肌细胞的电生理特性。利用本协作研究组成员在前期工作中分别获得的质粒载体高表达TNNI3K转染细胞株(P19CL6/TNNI3K)和FLAG多肽标签质粒转染P19CL6细胞株(P19CL6/FLAG),作为本实验待用的基因修饰干细胞。实验共分四组(i)假手术对照组(Control组)(ii)单纯心肌梗死+生理盐水注射组(NaCl组)(iii)心肌梗死+ P19CL6/ pCDNA6-FLAG注射组(FLAG组)(iv)心肌梗死+ P19CL6/ pCDNA6-FLAG -TNNI3K注射组(TNNI3K组)。1、结扎兔左冠状动脉回旋支的左室支造成心肌梗死模型;2、体外用1%DMSO诱导P19CL6/TNNI3K或P19CL6/FLAG两株细胞5天后,重新计数细胞,分别收集4x105个细胞,生理盐水200μl重悬,置于皮试用1ml注射器中,在兔梗死与正常心肌交界部位暗红色的充血带四周分6点注射,每点30μl;3、彩色多普勒超声心动图观测上述四个实验组第四周末心脏左室舒张末径(LVEDD)、左室收缩末径(LVESD)、左室壁和室间隔厚度,计算左室射血分数(LVEF);4、4道生理记录仪经颈动脉插管检测上述四个实验组第四周末血流动力学指标,包括左室舒张末压(LVEDP)、左室收缩末压(LVESP)、左室内压最大上升速率(+dp/dtmax)和左室内压最大下降速率(-dp/ dtmax);5、第四周末取四组含梗死区心肌组织,切片,HE(苏木精-伊红)染色,观察病理形态学差别。结果:P19CL6-TNNI3K和P19CL6-FLAG两株细胞在1%DMSO诱导后,均在大约10-12天,局部开始出现收缩,到约12-16天,几乎所有的片层出现同步的搏动。成功造成兔心肌梗死,按分组观察,术前、术后各组兔心率之间无明显差异。术后四周超声心动图显示,心梗各组心功能均较假手术组显著降低,但TNNI3K组心功能下降的程度显然轻于NaCl及FLAG两组,FLAG组和NaCl两组间无显著差异。比较左室壁和室间隔厚度,NaCl和FLAG两组可见有不同程度变薄,而TNNI3K组则与对照组相仿,组间差异显著。提示TNNI3K基因治疗能减轻心肌重构,改善心功能。进一步通过4道生理记录仪经颈动脉插管检测血流动力学指标,可见心肌梗死各组均有LVEDP明显升高,而LVESP和±dp/dtmax则均明显下降,提示左室收缩和舒张功能的减退,TNNI3K组的变化处于control和FLAG/ NaCl两者之间,但优于FLAG或NaCl组,后两组间无显著差异。心脏组织切片HE染色显示TNNI3K组心肌纤维化程度明显轻于NaCl和FLAG两组。结论:急性心肌梗死后,经开胸直接心外膜心肌局部注射使高表达TNNI3K基因,可有效改善梗死后的心脏重塑,减轻心肌纤维化,减少心脏舒缩功能的损害。第三部分:缺血性心脏病TNNI3K的血清学变化及临床意义目的:建立一个准确性高、可信度大、重复性好的ELISA实验条件,在此基础上检测正常人、急性心肌梗死、心肌梗死后心脏重构或缺血性心肌病出现心力衰竭、以及扩张性心肌病心力衰竭患者的TNNI3K血清水平并比较其差异,从临床角度探讨TNNI3K在缺血性心脏病中的作用及其临床意义。方法:1、从三株纯化的单克隆抗体中选定最合适的一株,并确定使用浓度,同时确定合适的血清样本与二抗的稀释倍数;建立纯化的TNNI3K蛋白的标准曲线;通过批内和批间重复性实验建立一个准确性高、可信度大、重复性好的ELISA实验条件;2、选择既往无心血管疾病的正常献血员为正常对照;冠状动脉粥样硬化性心脏病(CHD),包括急性心肌梗死(AMI)和缺血性心肌病心力衰竭(CHD/HF)(EF≤45%),扩张型心肌病(DCM)心力衰竭(EF≤45%)患者,均根据病史、症状、体征、客观检查(包括实验室检查、X线胸片、心电图、超声心动图、核素、核磁、冠状动脉造影等)综合作出确诊。抽取受试者清晨空腹肘静脉血2ml,不抗凝,2500 rpm/min离心10min,取血清分装,-20℃冻存备用。TNNI3K水平用上述建立的直接ELISA法测定;3、比较入选不同患者组间血清TNNI3K水平的差异及其临床意义。结果:1、正常对照和入选患者血清中均可检测到TNNI3K抗原。但无论CHD或DCM组,TNNI3K血清水平均高于正常对照(P<0.01),两类患组之间差异无统计学意义。2、在CHD患者中,比较不同发病时期AMI和CHD/HF两组血清TNNI3K浓度无明显不同;3、尽管缺血性心肌病和扩张型心肌病引起的心力衰竭发病机制不同,两组血清TNNI3K浓度亦无统计学差异。结论:TNNI3K基因与冠状动脉粥样硬化性心脏病密切相关。但以急性心肌梗死和以心力衰竭为临床发病的冠心病不同类型之间其血清水平并无差别;冠心病导致的心力衰竭和扩张型心肌病心力衰竭对TNNI3K血清水平的影响相似。