生物细胞内含磷代谢物及游离镁离子的核磁共振研究

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核磁共振(NMR)方法作为一种无损伤检测方法正越来越广泛地应用于活细胞、组织器官,乃至整体动物和人体中复杂小分子混合物的体内变化研究,这种全新的无损伤方法也用来测定生物细胞内游离镁离子的浓度、细胞内pH 值并取得了一定的进展。核磁共振测定生物细胞内游离镁离子的方法近年来多应用于临床医学、生物分析等方面。NMR 方法可以无损伤地对细胞内游离Mg2+浓度进行测定,同时可以考察细胞的代谢情况,允许在较长时间内连续进行观察。核磁共振方法研究Mg2+一般有两种方法:(31)P NMR和(19)F NMR。目前(31)P NMR 应用比较广泛,在研究Mg2+的同时可以对含磷代谢物等其它生理指标进行考察,还可以测定细胞内的pH,而且所研究的对象范围很广,包括离体器官、灌流心脏、悬浮细胞、贴壁细胞及血小板等。本文采用(31)P NMR 对cos-7 细胞、兔血小板和人血小板等样品进行了分析测定,并合成了(19)F NMR 测定镁离子的指示剂5F-APTRA。本论文共包括4 章。第1章综述了利用核磁共振方法来考察生物细胞内含磷小分子代谢物以及游离镁离子浓度的研究现状。第2 章采用(31)P NMR 方法考察了贴壁细胞及血小板的含磷代谢物以及细胞内pH。将培养的贴壁细胞cos-7 在对数生长期进行收集,离心稀释成浓度大于108个/mL 的细胞悬液,装进核磁共振管进行31P NMR 的测定。然后对所得谱图进行分析,根据无机磷(Pi)的化学位移的变化测定细胞内的pH。兔血小板由抽取新鲜的兔血经离心得到,人血小板由医院提供。将两者分别进行31P NMR 的测定,考察了其中含磷代谢物及其pH值。测得cos-7 细胞和兔血小板的无机磷化学位移分别为4.69 和4.64,pH 分别为5.58和5.39。第3 章建立了31P NMR 法测定镁离子的方法,ATP 与细胞内游离的镁离子结合,通过利用测量ATP 的磷的α和β峰的化学位移差值,能精确确定MgATP 和整个ATP 的比值,而不需要在细胞样品与对照组中加入内标来确定化学位移。根据模拟细胞内离子强度和酸度等条件下MgATP 的解离常数KDMgATP,能计算出游离镁离子的浓度。第4 章建立了(19)F NMR 测定镁离子的方法并进行了5F-APTRA 指示剂的合成:原料2,4-二氟硝基苯经过与氢氧化钾反应生成5-氟-2-硝基酚,然后催化氢化生成5-氟-2-
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