【摘 要】
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本研究主要围绕着粘虫中肠V-ATP酶中的两个蛋白质和小麦条锈菌相关蛋白的纯化进行研究。分为两个部分:一是苦皮藤素V对东方粘虫中肠V-ATP酶A、B亚基复合物ATP水解抑制的研究;二是小麦条锈菌（Puccinia Striformis f.sp.Tritici,pst）效应蛋白pst-268,pst-4941,pst-5578及靶标蛋白Ta ISP的表达纯化。苦皮藤素是从苦皮藤中分离出的对农业害虫具
【基金项目】
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陕西省自然科学基础研究计划（2017JM3004）；
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本研究主要围绕着粘虫中肠V-ATP酶中的两个蛋白质和小麦条锈菌相关蛋白的纯化进行研究。分为两个部分:一是苦皮藤素V对东方粘虫中肠V-ATP酶A、B亚基复合物ATP水解抑制的研究;二是小麦条锈菌（Puccinia Striformis f.sp.Tritici,pst）效应蛋白pst-268,pst-4941,pst-5578及靶标蛋白Ta ISP的表达纯化。苦皮藤素是从苦皮藤中分离出的对农业害虫具有毒性的化合物。苦皮藤素可以在昆虫的中肠上皮细胞中与液泡ATP酶的亚基H,A和B结合,然而苦皮藤素的作用机制仍然存疑。在研究中,V-ATPase A亚基突变体TSCA的可溶性复合物能够避免ADP水解产物和V-ATP酶B亚基增加所引起的反馈抑制,并使用亲和层析进行纯化,纯化后的复合物的ATP水解常数经测定为268（?）M,苦皮藤素对ATP水解的抑制常数为10.0（?）M。结果表明苦皮藤素抑制ATP水解,产生杀虫效果。另外,AB复合物的同源建模和分子对接结果表明,苦皮藤素能够在ATP的结合位点上竞争性结合AB复合物,以此抑制ATP水解。这些发现表明AB亚基复合物是苦皮藤素的潜在目标之一,对理解苦皮藤素和V-ATP酶间的相互作用很有意义。小麦条锈病具有毁灭性病害,严重影响着我国小麦生产和粮食安全。其中小麦条锈菌吸器中的效应蛋白在侵染宿主过程中发挥重要作用,目前病原菌效应蛋白利用氨基酸序列无法检索到任何与效应蛋白同源的保守结构,因此解析此类效应蛋白的三维结构,可为深入研究该效应蛋白的功能提供基础,是从原子水平阐述效应蛋白致病机理的重要手段。本文研究了其中三个重要的效应蛋白pst-268,pst-4941,pst-5578及小麦蛋白Ta ISP。用不同的载体PET-32a-PP来表达pst-268,pst-4941,pst-5578与Ta ISP,PET-32a-PP含有Prescission Protease酶酶切位点,可以将表达出来的融合蛋白的标签切掉,方便后续的互作验证及结构测定。
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