一、研究背景及目的:梓醇是地黄最主要的有效成分之一。研究表明,梓醇对老年性疾病,如:脑卒中、帕金森、老年痴呆、糖尿病等有显著的治疗作用。上述脑疾病难以恢复的主要原因与神经元细胞内在活性低下和轴突再生困难密切相关,mTOR信号通路是细胞生长活性调控的关键,mTOR是细胞能量代谢和蛋白合成的中央调控器,下游蛋白S6磷酸化表达水平可间接表征mTOR活性,并常作为神经元生长状态的分子标志。p-S6表达下降,细胞内在活性降低,损伤后轴突再生能力减弱,无法长久地维持细胞活性,导致再生的轴突难以长时间维持和存活。研究表明,miRNA-124是PI3K/AKT信号通路的上游,对PI3K和AKT蛋白表达有调节。且miRNA-124分布具有脑特异性。在脑卒中疾病中,miRNA-124与神经元保护有关。因此,如何调控PI3K/AKT/mTOR上下游信号实现诱导和维持细胞内在活性是防治衰老相关脑疾病关键。课题组前期研究发现:梓醇可促进离体大鼠皮质神经元轴突生长,促进BDNF、TrkB、GAP-43表达,提示梓醇对生理性和病理性衰老有防治作用。本课题提出梓醇可能调控miRNA-124,通过PI3K/AKT/mTOR通路诱导细胞内在活性,促进轴突生长,可能是其防治老年性疾病的分子机制。本研究拟制备逐渐衰老的生理与脑缺血病理模型,从诱导细胞内在生长活性的角度入手,从离体和整体层面,探讨梓醇对生理和病理状态下轴突生长的作用及其机制。二、研究内容及方法:主要研究内容包括以下三部分:第1部分:梓醇对不同年龄阶段大鼠皮质神经元和离体大脑皮质神经元细胞活性和轴突生长的调控通过整体和离体实验观察梓醇是否对不同年龄阶段大鼠皮质神经元以及离体大脑皮质神经元细胞活性和轴突生长有调控作用,并初步探讨其可能的机制。1.选择2、6、24m的雄性SD大鼠来模拟人类幼儿期、青年期和老年期,采用免疫荧光双标Map-2+p-S6和Map-2+GAP-43来观察梓醇是否对不同年龄阶段皮质神经元细胞活性和轴突生长有调控作用;采用Western blot来观察梓醇是否对不同年龄阶段皮质神经元p-S6和GAP-43蛋白表达有调节作用。2.原代培养24h内的大脑皮质神经元,运用MTT检测细胞存活,LDH检测细胞死亡,ELISA检测神经元BDNF分泌,免疫荧光p-S6和Map-2分别检测细胞活性与轴突生长,Western blot检测PI3K、t-AKT、p-AKT、t-mTOR、p-mTOR、p-S6、GAP-43、PTEN、BDNF、t-TrkB、p-TrkB蛋白表达。第2部分:梓醇对缺血脑区大鼠皮质神经元和离体氧糖剥夺再灌注模型神经元细胞活性和轴突生长的调控通过整体和离体实验观测梓醇是否对脑缺血后皮质神经元以及氧糖剥夺再灌注模型神经细胞活性和轴突生长有调控作用,并初步探讨其可能的机制。1.采用电凝法制备脑缺血模型,分别连续给药1、4、7d后检测各组大鼠饮水、饮食、体重、行为学的变化,免疫荧光双标检测Map-2+p-S6和Map-2+GAP-43共表达,Western blot检测p-S6和GAP-43蛋白表达。2.原代培养24h内的大脑皮质神经元,采用氧糖剥夺再灌注(OGD/R)模型模拟脑缺血,运用MTT检测细胞存活,LDH检测细胞死亡,ELISA检测神经元BDNF分泌,免疫荧光p-S6和Map-2分别检测细胞活性与轴突生长,Western blot检测PI3K、t-AKT、p-AKT、t-mTOR、p-mTOR、p-S6、GAP-43、PTEN、BDNF、t-TrkB、p-TrkB蛋白表达。第3部分:梓醇调控神经元细胞活性和轴突生长的可能机制通过离体实验探讨miRNA-124对PI3K/AKT/m TOR信号通路的调节,初步探讨其对神经细胞轴突生长调控的作用;在此基础上观察梓醇是否通过调控PI3K/AKT/mTOR上下游信号调控神经元轴突生长。1.使用miRNA-124激动剂与抑制剂,探讨miRNA-124对PI3K/AKT/mTOR信号通路的调控以及促轴突生长的效应。运用MTT检测细胞存活,LDH检测细胞死亡,免疫荧光Map-2检测轴突生长,qRT-PCR检测BDNF、TrkB、PI3K、AKT、S6基因表达的变化,Western blot检测PI3K、t-AKT、p-AKT、t-mTOR、p-mTOR、p-S6、GAP-43、PTEN、BDNF、t-TrkB、p-TrkB蛋白表达的变化。2.探讨梓醇是否对miRNA-124有调控作用,及梓醇是否可通过调控miRNA-124调节PI3K/AKT/mTOR通路诱导神经元细胞活性促进轴突生长。运用MTT检测细胞存活,LDH检测细胞死亡,免疫荧光Map-2检测轴突生长,qRT-PCR检测microRNA124、PI3K、AKT、S6基因表达的变化,Western blot检测PI3K、AKT、t-mTOR、p-m TOR、p-S6、GAP-43蛋白表达的变化。三、研究结果:1.梓醇诱导正常大鼠皮质神经元细胞活性并促进轴突生长1.1在体实验:随着年龄的增长,神经元的生长活性减缓或降低,轴突再生能力下降;一定浓度梓醇可上调p-S6蛋白表达诱导不同年龄段SD大鼠皮质神经元细胞活性,上调GAP-43蛋白表达促进不同年龄段SD大鼠皮质神经元轴突生长。1.2离体实验:梓醇可促进生理状态下皮质神经元细胞存活,减少细胞死亡,促进BDNF分泌,改善神经元生长微环境,达到神经保护作用;且可以诱导皮质神经元细胞活性促进轴突生长,达到神经修复的作用。其机制与调控PI3K/AKT/mTOR信号通路有关。2.梓醇上调缺血脑区大鼠皮质神经元和离体氧糖剥夺再灌注模型神经元细胞活性并促进轴突生长2.1在体实验:梓醇能促进脑缺血大鼠饮水、饮食,增加其体重;促进脑缺血大鼠神经行为学功能的恢复;上调p-S6蛋白表达诱导脑缺血大鼠皮质神经元细胞活性,上调GAP-43蛋白表达促进轴突再生,达到神经修复的作用。在本课题观察的时间内,细胞活性维持的时间可达7d。2.2离体实验:梓醇可促进氧糖剥夺再灌注病理状态下皮质神经元细胞存活,减少细胞死亡,促进BDNF分泌,达到神经保护的作用;且可以诱导皮质神经元细胞活性促进轴突生长,达到神经修复的作用。其机制与调控PI3K/AKT/mTOR信号通路有关。3.梓醇下调miRNA-124,激活PI3K/AKT/mTOR信号通路,促进神经元轴突生长3.1离体实验:抑制miRNA-124表达,可减少皮质神经元细胞死亡,促进其存活,并促进轴突生长,其机制可能与激活PI3K/AKT/mTOR信号通路有关。3.2 OGD/R病理状态下,皮质神经元细胞miRNA-124表达升高,梓醇可逆转此现象,即下调miRNA-124表达。3.3梓醇可下调miRNA-124表达,激活PI3K/AKT/mTOR信号通路,促进OGD/R皮质神经元细胞存活,减少细胞死亡,并促进轴突再生。四、研究结论:梓醇下调miRNA-124,激活PI3K/AKT/m TOR通路,诱导神经元细胞内在活性,促进轴突生长。