实验目的:　　采用激光共聚焦显微镜成像方法实时记录乙酰胆碱(acetylcholine,ACh)引起的昆明小鼠胰腺腺泡细胞的胞质钙振荡(calcium oscillations),探讨图像数据的分析处理方案,并以此为基础,较系统地研究槲皮素(quercetin,Que)、替加色罗(tegaserod,Teg)、白藜芦醇(resveratrol,Res)、埃他卡林(iptakalim,Ipt)和甲苯磺丁脲(tolbutamide,Tol)等相关药物对钙振荡的影响。　　实验方法:　　1.昆明小鼠胰腺腺泡细胞的分离:取成年昆明鼠(25~50g,雌雄不限),麻醉处死后取其胰腺,注入胶原酶液(150～200U/ml);在水浴摇床37℃下消化6min,取出振摇,再消化2min后,取上清液于2mL细胞标准液中,用移液枪吹打100次,加标准液至5mL,以1000转/分的速度离心1min,去上清;重复上述离心一次,去上清,再加入适量标准液,得到腺泡细胞液分装备用。　　2.钙振荡的激光共聚焦显微镜成像:静置后的腺泡细胞液用fluo4-AM(一种钙指示剂,终浓度为0.022～0.033g/L)染色15min,ACh(及一些相关药物)通过微量灌流系统按一定的时间次序作用于细胞上,激光共聚焦显微镜扫描记录此过程中胞内的钙信号变化。　　3.图像数据的分析处理:实验所获得的图像数据先用软件FV10-ASW2.1Viewer和ImageJ进行初处理,得到各细胞的钙信号随时间变化的曲线;再利用EXCEL处理该曲线数据,按一定标准筛选出有效细胞的数据,并进一步计算平均钙释放量、钙振荡频率、钙振荡延时等参数;最后对所得参数分组进行统计分析。　　主要实验结果和结论:　　1.在我们的实验系统中,ACh(400nM,加有0.1％DMSO助溶剂)可较稳定地引起胰腺腺泡细胞产生钙振荡:平均钙释放量为1.41±0.02(F/F0),钙振荡频率为0.048±0.001Hz,n=57。该反应可被阿托品(1μM)完全阻断。此结果表明我们已经成功建成胰腺腺泡细胞钙振荡的成像研究方法,而且我们观察到的钙振荡是通过M受体起作用的。　　2.Que对ACh引起的胰腺腺泡细胞胞质钙振荡的影响:我们测试了多个浓度Que的效应,发现50μM的Que(n=53)可使胰腺腺泡细胞的平均钙释放量增加约16.7%,钙振荡频率增加约25.1%。可见一定浓度的Que可明显增强胰腺腺泡细胞钙振荡。　　3.Teg对ACh引起的胰腺腺泡细胞胞质钙振荡的影响:我们测试了两个浓度Teg的效应,发现50μM的Teg(n=30)和200μM的Teg(n=64)分别使胰腺腺泡细胞的平均钙释放量减少约7.5%和16.8%,钙振荡频率减少约15.7%和9.1%。可见一定浓度的Teg可明显减弱胰腺腺泡细胞钙振荡。　　4.Res对ACh引起的胰腺腺泡细胞胞质钙振荡的影响:我们测试了多个浓度Res的效应,发现30μM的Res(n=33)可使胰腺腺泡细胞的平均钙释放量减少约13.1%,钙振荡频率减少约19.2%。可见一定浓度的Res可明显减弱胰腺腺泡细胞钙振荡。　　5.Ipt对ACh引起的胰腺腺泡细胞胞质钙振荡的影响:我们测试了多个浓度Ipt的效应,发现200μM的Ipt(n=50)可使胰腺腺泡细胞的平均钙释放量减少约5.8%,钙振荡频率减少约8.1%。可见一定浓度的Ipt可明显减弱胰腺腺泡细胞钙振荡。　　6.Tol对ACh引起的胰腺腺泡细胞胞质钙振荡的影响:我们测试了多个浓度Tol的效应,发现200μM的Tol(n=68)可使胰腺腺泡细胞的平均钙释放量减少约12.9%,钙振荡频率减少约6.2%。可见一定浓度的Tol可明显减弱胰腺腺泡细胞钙振荡。　　7.Ipt和Tol对ACh引起的胰腺腺泡细胞胞质钙振荡的影响:我们测试了多个浓度组合Ipt+Tol的效应,发现Ipt200μM+Tol200μM(n=32)的组合可使胰腺腺泡细胞的平均钙释放量减少约19.5%,钙振荡频率减少约11.7%。可见一定浓度组合的Ipt+Tol可明显减弱胰腺腺泡细胞钙振荡。　　以上结果为进一步的后续研究提供了有益线索。