研究背景：乳腺癌是女性最多发的恶性肿瘤，近年来发病率呈逐年上升趋势，并且发病年龄逐渐年轻化，使得这一疾病的危害更加显著。雌激素受体(ER)是乳腺癌细胞的一个重要生物学标志。依据细胞的ER状态，可将乳腺癌分为ER阳性细胞和ER阴性细胞。目前发现ER分为ERα和ERβ两种亚型，由于ERβ在乳腺癌细胞中表达极低，故ER阳性细胞通常是指ERα阳性的细胞。相比于ER阳性细胞，ER阴性乳腺癌细胞增殖能力强，更容易转移和复发，预后较差。通过转染外源性的ER基因进入ER阴性乳腺癌细胞中，并建立稳定表达ER的细胞株，可能是一种降低ER阴性乳腺癌细胞增殖和迁移能力的方法，相关文献还较少报道。IL-8属于趋化因子CXC基因家族，IL-8具有促进肿瘤生长、迁移和转移的作用，也是影响乳腺癌进展的重要指标之一。研究发现ER阴性乳腺癌细胞高表达IL-8，是其具有较高的侵袭性和转移性的原因之一。在瞬时转染ERα基因的ER阴性细胞，ERα具有下调IL-8的表达的能力。目前，稳定转染ERα对ER阴性乳腺癌细胞IL-8分泌情况的报道还较少。COX-2是一个编码71KDa蛋白，在结肠、胃、食道和肺等上皮组织肿瘤细胞中，COX-2呈过表达。COX-2过表达可以促进新生血管生成、促进肿瘤细胞增殖、抑制凋亡、促进播散潜能、上调HER-2表达、诱导芳香化酶合成等，从而促进恶性肿瘤发生发展。有文献报道COX-2的表达和肿瘤组织的ER状态相关。在MDA-MB-231等ER阴性的乳腺癌细胞中COX-2有较高表达，而在MCF-7等ER阳性的乳腺癌细胞中未见其表达，这可能是ER阴性乳腺癌细胞恶性程度较高的原因之一。VEGF-C是特异性的促淋巴管生成因子，可诱导淋巴管内皮细胞的增殖与淋巴管的生成，促进胚胎和肿瘤中淋巴管的新生与淋巴网络形成。淋巴转移是乳腺癌的主要转移途径之一，因此VGEF-C对乳腺癌的侵袭和转移具有重要的意义。VEGF-C激活淋巴管内皮细胞上的VEGFR-3，诱导磷脂酰肌醇3-激酶信号通路使p42/p44丝裂原活化蛋白激酶和蛋白激酶B信号通路激活，发生级联反应，保护淋巴管内皮细胞免于血清来源诱导的凋亡，促淋巴管内皮细胞增殖和迁移，促淋巴管生成。病理学研究发现，VEGF-C的表达也和ER状态相关，在ER阴性的乳腺癌细胞中VEGF-C呈高表达，并且其表达的量和肿瘤的大小，组织分级，核分级，血管侵袭以及淋巴结状态高度相关。　　 目的：选择ER阴性细胞株MDA-MB-231，通过转染外源性的ER基因进入该乳腺癌细胞中，并建立稳定表达ER的细胞株，观察ER对ER阴性乳腺癌细胞增殖和迁移能力的影响。选取三种与ER受体密切相关并影响乳腺癌细胞活性的三个生物学指标(IL-8，COX-2和VEGF-C)进行测定，阐述ER影响ER阴性乳腺癌细胞生物学特性的机制，为进一步深入研究打下基础。　　 方法：　　 ⑴乳腺癌细胞MDA-MB-231和MCF-7均在含10％FBS的无酚红DMEM培养液中培养，培养条件：5％CO2、37℃、95％湿度。两种细胞进行功能实验前48小时换用含10-8 M17-β-雌二醇的无酚红DMEM培养基培养。　　 ⑵pEGFP-C1-ERα质粒由Prof.Mancini(Baylor College of Medicine，USA)惠赠。经酶切鉴定和DNA序列测定后，使用Lipofectin2000转染MDA-MB-231细胞，转染48小时后培养基中加用G418(800ug/ml)，两周后筛选出稳定表达的克隆，并通过蛋白免疫印迹法鉴定阳性克隆中ERα的表达。　　 ⑶细胞的增殖和迁移实验通过MTT实验和流式细胞仪分别测定稳定转染ERα的MDA-MB-231细胞、MDA-MB-231细胞及MCF-7细胞的增殖能力。使用Transwell小室测定三种细胞株的迁移能力。　　 ⑷细胞IL-8的合成和分泌使用荧光定量PCR测定MDA-MB-231细胞、稳定转染ERα的MDA-MB-231细胞及MCF-7细胞的IL-8 mRNA的表达，使用ELISA法测定细胞上清液IL-8的浓度。　　 ⑸细胞COX-2蛋白的表达通过蛋白免疫印迹法测定MDA-MB-231细胞、稳定转染ERα的MDA-MB-231细胞及MCF-7细胞COX-2的表达。　　 ⑹细胞上清液VEGF-C的分泌使用ELISA法测定MDA-MB-231细胞、稳定转染ERα的MDA-MB-231细胞及MCF-7细胞上清液VEGF-C的浓度。　　 ⑺计量资料运用均数±标准差进行统计描述分析。计量资料组间均数的比较使用方差分析，组间两两比较使用Bonferroni法。细胞周期中的构成比的比较采用Pearson卡方检验。P＜0.05为具有统计学差异。采用所有数据使用SPSS16.0软件处理。　　 结果：①通过GFP荧光示踪和WesternBlot检测，确定成功转染并筛选出ERα阳性表达的MDA-MB-231细胞株。②通过MTT测定，(ER+)MDA-MB-231细胞的增殖能力明显降低(P＜0.05)，其增殖能力和MCF-7细胞相当。MDA-MB-231细胞稳定转染ERα基因后，细胞周期中G1期比例明显升高，S期比例明显降低(P＜0.01)，ER基因抑制了肿瘤细胞DNA的复制，降低了肿瘤细胞的增殖。MDA-MB-231细胞稳定转染ER基因后，其迁移细胞数目明显降低，洗脱液OD值明显降低(P＜0.01)。③通过荧光定量PCR测定，MDA-MB-231细胞稳定转染ERα基因后，IL-8mRNA的合成明显降低(P＜0.05)，但仍然高于MCF-7细胞(P＜0.05)。通过ELISA法测定细胞上清液，MDA-MB-231细胞稳定转染ERα基因后，其上清液的IL-8表达明显降低(P＜0.05)，但仍然高于MCF-7细胞(P＜0.05)。④MDA-MB-231细胞稳定转染ERα基因后，COX-2蛋白的表达明显降低。⑤转染后细胞上清液的VEGF-C浓度明显降低(P＜0.05)，但仍然高于MCF-7细胞(P＜0.05)。　　 结论：⑴通过转染pEGFP-C1-ERα质粒，成功建立稳定表达ERα的MDA-MB-231细胞株。⑵稳定转染ERα基因抑制了MDA-MB-231细胞的增殖和迁移能力。⑶稳定转染ERα基因下调了MDA-MB-231细胞IL-8的合成和分泌，下调了COX-2蛋白的表达以及VEGF-C的分泌。⑷ERα基因抑制MDA-MB-231细胞的增殖和迁移能力可能和IL-8，COX-2和VEGF-C的下调有关。