石榴褐变的生物学基础及活性成分研究

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褐变一直是限制石榴保鲜的重要因素之一,石榴含有丰富的活性物质,具有很高的保健及药用价值,近年来石榴保鲜贮藏及石榴资源开发都受到广泛关注。本研究探讨了石榴褐变的生物学基础及控制措施;建立了石榴活性物质的超声波萃取工艺和大孔吸附树脂纯化工艺;比较分析了石榴不同部位的生物活性;研究了石榴活性物质的季节性变化规律及加工方式对某些活性成分的影响;并首次鉴定了某些未知成分(石榴花花青苷)的化学结构。主要结果如下:   1、以大青皮和大红袍两个品种的石榴为材料,探讨了在室温下耐贮性与果皮显微结构和超微结构的关系。结果表明,大青皮石榴比大红袍石榴耐贮藏。经显微镜、激光共聚焦扫描(CLSM)及电子扫描显微镜(SEM)观察,大红袍石榴外表皮薄,皮层细胞排列疏松,石细胞较少,果皮表面的蜡质呈不规则的片状;而大青皮石榴外表皮较厚,皮层细胞排列紧密,石细胞较多,果皮蜡质表面有结晶状物。随贮藏时间延长,石榴果皮蜡质层脱落,气孔也逐渐闭合,气孔、维管束等部位易发生褐变。说明果皮结构特点与耐贮性相关,石榴果皮结构致密则耐贮性好;氧气是促使褐变发生的重要条件。   2、考察了纯O2(100%O2)、短波紫外线(UV-C)、复合涂膜及微波处理对大红袍、大青皮石榴贮藏品质的影响,并测定了处理之后贮藏期或货架期石榴主要生理和品质指标。1)分别用100%O2和UV-C处理大红袍石榴,在室温下放置18天,纯氧和UV-C处理均能降低石榴的褐变指数,抑制PPO活性,维持较高的多酚含量,至第18天时的褐变指数分别比对照降低9%和15%。纯氧处理还促进籽粒可溶性固形物含量在早期阶段的提高,使花青苷含量稳定缓慢增加,对可滴定酸含量影响较小。而UV-C处理增加了果皮失水,但对石榴的食用品质基本没有影响。纯氧和UV-C处理对石榴贮藏保鲜有一定的价值,但还有待深入研究。2)以大青皮石榴为试材,研究了壳聚糖、壳聚糖与石榴皮提取物复合涂膜保鲜剂对石榴果实贮藏期间品质变化的影响。结果表明:在温度为(0±2)℃条件下贮藏,采用1%壳聚糖溶液涂膜(T1)以及加入1%(T2)和2%(T3)石榴皮提取物的复合涂膜,能有效保持较高石榴果粒可溶性固形物含量(SSC)和花青苷含量,但对可滴定酸(TA)含量的影响不明显,T2和T3对提高花青苷含量的作用更明显,并表现剂量效应;涂膜处理在8周之前具有抑制褐变的作用,之后却加重了褐变,其中T2褐变最轻。壳聚糖与石榴皮提取物复合有利于保持石榴的食用品质和在短期内(8周)的感官品质。3)利用微波炉对采后大青皮石榴果实进行辐照处理,研究处理后果实在货架期的生理变化及贮藏品质。结果表明:10~20 s短时微波处理可抑制果皮多酚氧化酶(PPO)活性,减轻果实的褐变程度,保持果皮较高的多酚含量,减缓可滴定酸(TA)含量降低的速度,可溶性固形物含量(SSC)较高。10~20 s是适宜的微波处理时间,超过20 s会产生热伤害,加重果实褐变。   3、在单因素试验的基础上,采用L9(34)正交试验优化工艺条件,研究了石榴叶单宁和石榴籽油的超声波萃取工艺。石榴叶单宁萃取的最佳工艺为:料液比1:20(g/ml),超声波功率100 W,频率为40 kHz,提取温度40℃,提取时间50 min,最优条件下的提取量为225.12 mg/g,提取率为94.63%。提取石榴籽油的最佳工艺条件为:料液比1:7(w/v),超声波功率70 W,提取温度40℃,提取时间50 min,出油率达19.81%。同时还研究了石榴籽油的理化特性。超声波辅助提取与常规法浸提和微波提取相比,具有提取率高、提取时间短、所需温度低等优点,便于石榴活性物质的工业化规模生产。   4、以石榴皮为材料,从D101、AB-8和DA-201三种大孔吸附树脂中筛选出D101树脂,进一步研究D101对石榴皮提取物中多酚和总黄酮的纯化工艺。所得最佳纯化工艺为:上柱液浓度5 mg/ml,pH5,上柱液体积4.5 BV,上柱液流速2 BV/h,以60%乙醇溶液为洗脱液,洗脱流速2 BV/h,洗脱液体积为2.5 BV。在此条件下,多酚和总黄酮的含量由30.43%和17.12%分别提高到53.55%和35.71%。同时对纯化前后的抗氧化活性进行了比较研究。结果表明,石榴皮提取物经纯化后清除DPPH·自由基和抗油脂过氧化能力都强于粗提物。   5、为比较石榴果皮、石榴叶、石榴籽和石榴花(花瓣、花蕊和花托)等部位提取物的抗氧化活性,以猪油和大豆油为底物通过测定.POV和MDA含量来评价提取物对油脂的抗氧化效果,通过DPPH·、还原力、羟基自由基(·OH)、DNA降解以及DNA断裂方法测定,来评价不同部位的抗氧化能力;还比较了不同部位提取物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制作用。采用高效液相色谱(HPLC)法比较分析了不同部位中鞣花酸和齐墩果酸的含量。结果表明:1)除石榴籽外,石榴果皮、石榴叶、石榴花(花瓣、花蕊和花托)等部位具有很强的清除DPPH·自由基能力和抗油脂氧化的能力,还表现较强的抑菌活性,其中石榴皮的抗氧化能力和抑菌活性最强,石榴籽最差,花瓣、花蕊和花托三者基本相当,石榴叶较差。2)花瓣、花蕊和花托3种部位在各种测试中均表现显著的抗氧化活性,其中,花托最强的抗氧化活性,在本研究中的最高浓度下对自由基的抑制率分别为:DPPH·(44.86%),·OH(61.21%),DNA降解(44.47%),还原力为63.96%,其过氧化值(POV)为68.51 meq/kg。DNA断裂测定结果也证明石榴花提取物对DNA分子能起到保护作用。3)几种成分的分布规律如下,齐墩果酸:花瓣(6.62 mg/g)>花蕊(4.02 mg/g)>叶片(1.41 mg/g)>花托(0.79 mg/g)>果皮(0.28 mg/g);熊果酸:花蕊(6.22 mg/g)>花瓣(5.91 mg/g)>叶片(2.9 mg/g)>花托(1.06 mg/g)>果皮(0.33mg/g);鞣花酸:花瓣(5.78 mg/g)>花托(5.22 mg/g)>花蕊(4.93 mg/g)>叶片(3.67mg/g)>果皮(2.12 mg/g)。结果显示多酚含量与各种活性之间具有显著的相关性,说明多酚是主要的活性物质。还表明石榴叶、果皮和花的等部位均可作为提取天然的抗氧化物质(多酚)及三萜的原料,尤其石榴花具有良好的开发前景。   6、对石榴叶中的多酚、黄酮、生物碱的含量及其的抗氧化活性在4-9月生育期内的变化规律进行了研究;为比较不同加工方式对石榴叶茶酚类物质及抗氧化活性的影响,采用叶龄约1个月充分展开的石榴鲜叶,杀青烘干作为对照,按照传统的加工工艺分别制成绿茶和红茶,应用分光光度法和HPLC法对茶样中多酚类物质进行了分析,通过测定DPPH·自由基的清除力来评价茶样的抗氧活性。结果表明:1)其中多酚和黄酮的含量在幼叶中的含量最高,然后快速下降,5月之后呈缓慢升高的趋势,而生物碱的含量在幼叶中极低,之后不断升高;测定的三种活性物质的积累量在生育期内都是不断增加的;抗氧化活性的变化与多酚一致,与多酚呈显著的正相关。根据以上结果确定用于制作石榴叶绿茶的最佳采摘期为5月之前,作为提取活性物质的原料的最佳采摘期为8月之后。2)与干叶相比,绿茶中总酚及儿茶素含量基本保持不变,而红茶中总酚和儿茶素下降明显,分别下降了30.8%和60.3%,与之相应,红茶的抗氧化活性表现明显的下降;相反,绿茶中茶红素和茶黄素含量稍有增加,而红茶增加显著,分别增加了194.3%和181.3%;绿茶和红茶中鞣花酸含量减少幅度均较小,仅减少6.3%和9.3%。因此,加工成绿茶可保持较高的多酚含量和抗氧化活性,加工成红茶则可改善茶的感官品质。   7、为分离、纯化和鉴定石榴花中的花青苷成分,以50%甲醇为溶剂从石榴花中提取花青苷,并经乙酸乙酯、正己烷和正丁醇萃取后用大孔树脂初步纯化,再用SephadexLH-20分离得到花青苷成分,采用紫外-可见光谱、ESI-MS质谱和核磁共振(1HNMR和13CNMR)波谱法对其进行结构鉴定。结果从石榴花提取物中分离出2种花青苷,分别是天竺葵素-3.5-二葡萄糖苷(pelargonidin3.5.diglucoside)、天竺葵素-3-葡萄糖苷(pelargonidin3-glucoside)。2种花青苷均具有很强的抗氧化活性,其中,天竺葵素-3-葡萄糖苷比天竺葵素-3.5-二葡萄糖苷抗氧化活性强。花青苷是石榴花抗氧化作用的重要成分。
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