【研究背景及目的】肝纤维化（hepatic fibrosis）是一种以细胞外基质（extracellular matrix,ECM）在肝内过度沉积为特征的肝脏慢性损伤过程,是一种多因素调节的过度修复反应。既往观点认为,肝纤维化导致的慢性损伤无法逆转。近年来,多项研究发现,肝纤维化是一个动态变化的可逆性病理过程,通过早期干预,肝纤维化进展可以被抑制甚至逆转。较早研究表明,肝星状细胞（hepatic stellate cell,HSC）的活化与增殖是肝纤维化发生发展的中心环节。HSC在正常肝组织中处于静息状态,在受到病毒、寄生虫等病原体感染或CCl₄、黄曲霉等理化因素刺激时,可转分化为肌成纤维细胞（myofibroblast,MFS）,合成并分泌ECM。因此,深入挖掘HSC活化的分子机制,寻找调控HSC活化的靶点,是治疗肝纤维化的重要方法之一。长链非编码RNA（long non-coding RNA,lnc RNA）是一类长度在200bp-100kbp之间、不具有蛋白质编码功能的RNA的统称。lnc RNA不仅可以与转录因子、染色质组蛋白以及其他转录调节蛋白相结合,直接调控基因表达和染色体活性;也参与m RNA翻译、剪切、蛋白质降解和磷酸化修饰、RNA结合蛋白亚细胞定位、细胞骨架构成等机体重要生理过程,还可以作为竞争性内源RNA（competing endogenous RNA,ce RNA）结合其它内源RNA,如微小RNA（micro RNA,mi RNA）等,在转录后水平调控相关基因的表达。自噬（autophagy）是一种溶酶体依赖的降解途径,广泛存在于真核细胞内,通过降解损伤或多余细胞器维持细胞能量平衡。根据被消化底物的不同,自噬分为巨自噬、微自噬和分子伴侣介导自噬。本研究所指自噬为巨自噬。在基础条件下,细胞内自噬发生处于较低水平;但在饥饿、缺氧、内质网应激、病原微生物感染等条件下,自噬水平升高。自噬是真核细胞对抗感染、神经退行性疾病和肿瘤的重要调控机制,自噬途径的异常也与多种疾病的病理过程相关。既往研究发现,自噬可促进HSC活化,导致肝纤维化进展;抑制自噬能够下调Ⅰ型前胶原m RNA表达,削弱HSC活性。其中,自噬相关基因5（ATG5）是重要的自噬相关基因之一。在肝纤维化进展过程中,ATG5表达上调,且这种高表达主要分布在肝小叶间隔及汇管区,与HSC分布一致。因此,通过抑制HSC ATG5表达及其下游自噬相关信号通路活性,进一步调控HSC活性可能为肝纤维化治疗提供新的靶点和手段。前期研究中,我们利用Arraystar Human Lnc RNAArray v2.0 8*60K芯片（涵盖30,215条m RNA和33,045条lnc RNA）分析正常人及肝硬化患者肝组织lnc RNA表达情况,从中筛选出肝硬化患者肝组织中上调的lnc RNA uc.420-,并在4种不同肝纤维化大鼠模型肝组织中进行验证。研究还发现,肝纤维化大鼠肝组织中mi R-194-5p表达下调,ATG5表达上调。沉默HSC-T6细胞株uc.420-,mi R-194-5p表达上调。因此,我们希望通过证实uc.420-、mi R-194-5p和ATG5之间的关系,阐明其对肝纤维化的作用机制,为肝纤维化的治疗提供新的可能方案。【实验方法】一、肝纤维化差异表达lnc RNA uc.420-靶基因的验证和人肝硬化肝组织、肝纤维化大鼠模型肝组织、不同活化状态HSC中uc.420-及其靶mi RNA mi R-194-5p及ATG5等自噬相关基因和纤维化相关基因差异表达1、通过mi Rmap网站进行生物信息学分析,预测mi R-194-5p与ATG5 3’-UTR之间可能存在的结合位点。2、设计携带uc.420-全长序列的野生型（wild type,WT）uc.420-报告基因质粒（WT-uc.420-）和uc.420-与mi R-194-5p预测结合位点序列突变的突变型（mutation type,MUT）uc.420-报告基因质粒（MUT-uc.420-）,合成mi R-194-5p类似物片段（mi R-194-5p mimic）及其阴性对照片段（NC mimic）,将WT-uc.420-、MUT-uc.420-分别与mi R-194-5p mimic或NC mimic共转染HEK-293细胞株,进一步证实mi R-194-5p为uc.420-直接调控靶基因。3、制备野生型ATG5 3’-UTR报告基因质粒（WT-ATG5 3’-UTR）和ATG5 3’-UTR与mi R-194-5p之间预测结合位点序列突变的突变型ATG5 3’-UTR报告基因质粒（MUT-ATG5 3’-UTR）,将WT-ATG5 3’-UTR和MUT-ATG5 3’-UTR分别与mi R-194-5p mimic、NC mimic共转染HEK-293细胞,证实ATG5为mi R-194-5p的直接调控靶基因。4、获得患者知情同意并签署相关同意书后,留取5例正常肝脏组织及5例确诊为肝硬化患者的肝组织标本。5、构建硫代乙酰胺（thioacetamide,TAA）肝纤维化大鼠模型本研究使用TAA法构建大鼠肝纤维化模型。TAA肝纤维化大鼠模型:将雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠随机分为肝纤维化模型组和对照组,每组10只。对照组按1ml/100g的剂量腹腔注射生理盐水3次/周,16W后处死,留取肝组织。肝纤维化模型组按照1ml/100g的剂量腹腔注射20mg/ml TAA溶液3次/周,16W后处死,留取肝组织。6、胶原酶改良原位循环灌流法分离SD大鼠原代HSC,将分离出的细胞分为3组:第1组为静息状态组,第2组用TGF-β1（2ng/ml）刺激3天,第3组用TGF-β1（2ng/ml）刺激7天。7、检测并验证uc.420-、mi R-194-5p、ATG5等自噬通路相关基因（ATG5、ATG7、LC3、Beclin 1和p62）和肝纤维化相关基因（TIMP2、MMP2、MMP9、COLⅠA1、Col-Ⅲ和α-SMA）表达差异。Real time RT-PCR检测肝硬化患者肝组织、肝纤维化大鼠模型肝组织、HSC活化过程中不同时间点（静息状态、第3天、第7天）uc.420-、mi R-194-5p表达差异。real time RT-PCR及western-blot检测肝硬化患者肝组织、肝纤维化大鼠模型肝组织以及HSC活化过程中不同时间点ATG5等自噬通路相关基因和肝纤维化相关基因表达差异。二、下调uc.420-调控ATG5信号通路及纤维化相关基因表达1、前期研究中,我们已经设计出uc.420-的小干扰RNA（small interfering RNA,si RNA）si-uc.420-。以si-uc.420-转染HSC-T6细胞株,沉默uc.420-表达,real time RT-PCR及western-blot检测下调uc.420-表达对mi R-194-5p、ATG5等自噬通路相关基因以及肝纤维化相关基因表达的影响。2、构建含有嘌呤霉素（purinemycin,PURO）抗性基因且沉默uc.420-表达的慢病毒重组质粒mi RZip-shuc.420-和含有PURO抗性基因的对照慢病毒重组质粒mi RZip-sh NC,包装、扩增获得下调uc.420-表达的慢病毒lenti-shuc.420-及对照病毒lenti-sh NC。3、绘制杀灭曲线,明确筛选培养基的PURO浓度。分别用lenti-shuc.420-和lenti-sh NC感染HSC-T6细胞株,用含PURO的筛选培养基筛选稳转株lenti-shuc.420--HSC-T6和lenti-sh NC-HSC-T6并扩增,抽提RNA和蛋白,在转录和蛋白水平检测抑制uc.420-表达对mi R-194-5p、ATG5等自噬通路相关基因以及肝纤维化相关基因表达的影响。4、分离大鼠原代HSC,贴壁后每隔2天换液,2ng/ml浓度的TGF-β1刺激7天后,分别用lenti-shuc.420-和lenti-sh NC感染活化的原代HSC细胞。在RNA水平检测抑制uc.420-表达对mi R-194-5p、ATG5等自噬通路相关基因以及肝纤维化相关基因表达的影响。三、下调uc.420-对活化HSC和HSC-T6细胞生物学活性和自噬活性影响1、扩增lenti-shuc.420--HSC-T6和lenti-sh NC-HSC-T6,对两种稳转株进行以下检测:transwell法检测迁移能力;CCK-8法检测增殖能力;流式细胞仪检测凋亡水平。2、TGF-β1（2ng/ml）刺激7天的大鼠原代HSC,分别以lenti-shuc.420-和lenti-sh NC感染。CCK-8法检测感染后大鼠原代HSC增殖能力;流式细胞仪检测转染后大鼠原代HSC凋亡水平。3、电镜观察lenti-shuc.420--HSC-T6和lenti-sh NC-HSC-T6细胞内自噬小体形成;双荧光腺病毒（Ad-m RFP-GFP-LC3）感染lenti-shuc.420--HSC-T6和lenti-sh NC-HSC-T6,共聚焦显微镜下观察m RFP-GFP-LC3融合蛋白,示踪自噬体形成、降解及分布情况,明确自噬流强弱。4、感染lenti-shuc.420-和lenti-sh NC的大鼠原代活化HSC,电镜观察感染后HSC细胞内自噬小体数量变化;Ad-m RFP-GFP-LC3感染慢病毒感染后的大鼠原代活化HSC,共聚焦显微镜下观察m RFP-GFP-LC3融合蛋白,示踪自噬体形成、降解及分布,明确自噬流强弱。四、统计学分析计量资料中服从正态分布则使用平均数±标准差（^—X±SD）表示,不服从正态分布则采用中位数（Q1,Q3）表示。服从正态分布的计量资料（方差齐性）的组间比较采用两组独立样本t检验;非正态分布或方差非齐性的组间比较则采用非参数检验。应用SPSS 21.0软件进行实验数据统计分析,双侧P<0.05则认为组间差异有统计学意义,双侧P<0.01则认为组间差异有显著统计学意义。【实验结果】一、筛选验证uc.420-下游靶基因1、生物信息学分析发现,uc.420-、mi R-194-5p与ATG5之间存在靶向调控关系。2、证实mi R-194-5p是uc.420-靶基因。分别将mi R-194-5p mimic、NC mimic和WT-uc.420-报告基因质粒、MUT-uc.420-报告基因质粒共转染HEK-293细胞,结果显示:与WT-uc.420-+NC mimic组相比,WT-uc.420-+mi R-194-5p mimic组的荧光素酶活性降低44.5%（P<0.01）（此部分重复验证,鉴定前期研究类似结果）;与MUT-uc.420-+NC mimic组相比,MUT-uc.420-+mi R-194-5p mimic组荧光素酶活性无明显变化。3、证实ATG5是mi R-194-5p的靶基因。分别将mi R-194-5p mimic、NC mimic和WT-ATG5 3′-UTR报告基因质粒、MUT-ATG5 3′-UTR报告基因质粒共转染HEK-293细胞,结果显示:与WT-ATG5 3′-UTR+NC mimic组相比,WT-ATG53′-UTR+mi R-194-5p mimic组的荧光素酶活性降低37.6%（P<0.01）;与MUT-ATG53′-UTR+NC mimic组相比,MUT-ATG5 3′-UTR+mi R-194-5p mimic组的荧光素酶活性无明显差异。二、人肝硬化组织、肝纤维化大鼠肝组织、大鼠原代活化HSC中uc.420-、mi R-194-5p、ATG5自噬通路相关基因及纤维化相关基因表达差异与对照组相比较,在人肝硬化肝组织、大鼠肝纤维化模型肝组织、大鼠活化HSC中,uc.420-表达显著上调,mi R-194-5p表达下调,ATG5等自噬通路相关基因在RNA和蛋白水平表达均上调,肝纤维化相关基因在RNA和蛋白水平表达均上调。三、体外下调uc.420-抑制ATG5自噬相关信号通路及纤维化相关基因表达1、Si-uc.420-和NC分别转染HSC-T6细胞株。转染后48h,real time RT-PCR检测发现,与NC组相比,si-uc.420-组uc.420-表达显著下调,mi R-194-5p表达显著上调。Real time RT-PCR和western blot检测发现,与NC组相比,si-uc.420-组ATG5等自噬通路及相关基因表达下调,纤维化相关基因表达受到抑制。2、分别对lenti-shuc.420--HSC-T6和lenti-sh NC-HSC-T6中抽提的RNA和蛋白检测。real time RT-PCR显示,与lenti-sh NC-HSC-T6组相比,lenti-shuc.420--HSC-T6组uc.420-表达较lenti-sh NC-HSC-T6组显著下调,mi R-194-5p表达上调。real time RT-PCR和western-blot法检测发现,与lenti-sh NC-HSC-T6组相比,lenti-shuc.420--HSC-T6组ATG5自噬通路及相关基因表达受到抑制,纤维化相关基因表达受到抑制。四、体外下调uc.420-抑制HSC-T6细胞株和活化大鼠原代HSC细胞生物学活性和自噬活性1、对稳转株lenti-shuc.420--HSC-T6和lenti-sh NC-HSC-T6行细胞活性检测发现:与lenti-sh NC-HSC-T6相比,transwell方法检测lenti-shuc.420--HSC-T6的迁移能力明显受抑制（P<0.05）;CCK-8法检测lenti-shuc.420--HSC-T6的增殖能力降低（P<0.05）;流式细胞仪检测lenti-shuc.420--HSC-T6的凋亡增加（P<0.05）。2、分别对lenti-shuc.420-和lenti-sh NC感染后的大鼠活化原代HSC检测发现:与lenti-sh NC组相比,CCK-8法检测lenti-shuc.420-组细胞增殖能力降低（P<0.05）;流式细胞仪检测lenti-shuc.420-组细胞凋亡增加（P<0.05）。3、分别对稳转株lenti-shuc.420--HSC-T6和lenti-sh NC-HSC-T6进行电镜和共聚焦显微镜观察。电镜观察发现:与lenti-sh NC-HSC-T6组相比,lenti-shuc.420--HSC-T6组细胞内自噬小体数量减少（P<0.05）。共聚焦显微镜观察发现:感染Ad-m RFP-GFP-LC3后,与lenti-sh NC-HSC-T6组相比,lenti-shuc.420--HSC-T6组细胞内自噬流减弱（P<0.05）。4、分别对感染慢病毒lenti-shuc.420-和lenti-sh NC的大鼠活化原代HSC进行电镜和共聚焦显微镜观察。电镜观察发现:与lenti-sh NC组相比,lenti-shuc.420-组细胞内自噬小体数量减少（P<0.05）。共聚焦显微镜观察发现:感染Ad-m RFP-GFP-LC3后,与lenti-sh NC组相比,lenti-shuc.420-组细胞内自噬流明显减弱（P<0.05）。【结论】1、生物信息学分析和体外实验证实mi R-194-5p是uc.420-的靶基因;ATG5是mi R-194-5p的靶基因。2、与对照组相比,人肝硬化肝组织、大鼠纤维化模型肝组织和不同时间点大鼠活化HSC中,uc.420-的表达上调,mi R-194-5p表达下调,ATG5等自噬通路相关基因及纤维化相关基因表达上调。3、沉默uc.420-表达可促进mi R-194-5p表达,进而抑制活化HSC中ATG5自噬信号通路及纤维化相关基因的表达。4、沉默uc.420-表达可抑制HSC活化及其生物学活性和自噬活性。