研究背景、存在的科学问题及研究意义昆虫的生长发育由多种激素共同调控,包括20-羟基蜕皮酮(20E)、保幼激素(JH)和胰岛素,20E与JH和胰岛素相互作用调控昆虫生长发育和蜕皮变态。昆虫变态期间体内发生着剧烈的变化,如幼虫中肠的凋亡、成虫中肠的形成、脂肪体的解体和重构、成虫盘的生长和脑结构的重塑等,20E在其中起着非常重要的作用。通常,蜕皮激素通过结合蜕皮激素的核受体(EcR)来发挥作用,起始20E早晚期基因的表达,启动变态程序,即20E基因组信号途径。近年来,越来越多的研究证明在经典的20E基因组信号途径之外,存在20E非基因组途径,即20E通过激活细胞膜上的受体引发胞内钙离子和cAMP水平的快速变化,进而引起一系列蛋白质的翻译后修饰,调控基因转录和变态发育。G蛋白偶联受体(GPCR)是一类七次跨膜的蛋白家族,在传递各种信号中起到重要的作用,是各种药物的作用靶标。研究发现GPCR作为固醇类激素的受体,在20E调控昆虫的变态发育中发挥作用。果蝇多巴胺蜕皮激素受体DmDopEcR可以结合20E类似物,被认为是20E的膜受体,但DopEcR在20E信号途径中的功能并不清楚,并且棉铃虫中还报道了另外两个传递20E信号的GPCR,但没有检测到它们结合20E。前期研究还发现20E进入细胞的量是受到控制的,但机制和生物学效应并不清楚。这些研究打破了 20E是通过自由扩散进入细胞与核受体结合启动相关基因转录的经典理论,其尚待阐明的科学问题对于确立类固醇激素的细胞膜受体及其信号途径的新理论具有重要的支撑意义。本论文用重大农业害虫棉铃虫(Helicoverpa armigera)为模型,研究DopEcR在20E信号途径中的功能并证明GPCR可以结合20E,GPCR控制20E进入细胞的机制和生物学效应,丰富和完善20E非基因组信号途径及调控昆虫变态发育的分子机制。研究结果完全变态昆虫在末龄幼虫的最后阶段停止取食,然后发生变态。但是,幼虫停止取食的机制尚不清楚。使用农业害虫棉铃虫作为模型,揭示了 20E与多巴胺受体(DopEcR)(一种G蛋白偶联受体)结合,以停止幼虫取食并促进化蛹。DopEcR在各种组织中均有表达,并在20E调节下的蜕皮变态过程中表达水平升高。幼虫取食阶段的20E滴度较低,而游走阶段的20E滴度较高。相比之下,多巴胺(DA)滴度在幼虫取食阶段较高,而在游走阶段较低。使用多巴胺受体抑制剂flupentixol阻断多巴胺受体或20E注射均可以减少幼虫的食物消耗和体重。敲降DopEcR可以抑制幼虫的取食、生长和化蛹。20E通过DopEcR促进细胞凋亡,DA通过DopEcR诱导细胞增殖。20E通过抑制DA诱导的细胞增殖和AKT的磷酸化来对抗DA功能。20E通过DopEcR诱导基因表达,并使细胞内钙离子和cAMP水平快速增加。20E诱导DopEcR与Gαs和Gαq相互作用。20E通过DopEcR诱导20E信号途径关键蛋白磷酸化和EcRB1-USP1转录复合物与蜕皮激素响应元件EcRE的结合。DopEcR可以在细胞膜或从细胞膜分离后结合20E。DopEcR结合20E位点的突变降低了 20E结合水平和相关的细胞快速反应。研究结果表明20E通过与DA竞争结合DopEcR,抑制幼虫进食并促进化蛹。在棉铃虫中阐明了一种GPCR(命名为GPCR-3)通过触发G蛋白介导的信号级联并形成四聚体促进20E进入细胞传递类固醇激素20E信号。通过虫体RNA干扰从棉铃虫转录组数据库中筛选出GPCR-3参与20E信号途径。虫体干扰GPCR-3导致延迟化蛹或形成嵌合蛹,抑制幼虫中肠和脂肪体的降解,并抑制20E诱导的基因表达。20E诱导GPCR-3与Gαq和Gαs相互作用,并使细胞内钙离子、cAMP和蛋白磷酸化迅速增加。GPCR-3定位于细胞质膜中,20E诱导下被GPCR激酶2(GRK2)磷酸化后内化降解脱敏20E信号,β-arrestin-1和网格蛋白介导GPCR-3的内化。GPCR-3可在细胞膜中和分离后在体外结合20E。20E与GPCR-3的结合诱导GPCR-3的同源二聚体形成同源四聚体,GPCR-3的同源四聚体促进20E进入细胞并传递20E信号。GPCR-3同源四聚体作为20E细胞膜受体并促进20E扩散进入细胞,控制不同组织中20E的滴度,进而调节变态发育中不同组织的发育命运—调亡或增殖生长。结论及科学意义1.本论文研究了 DopEcR在昆虫取食和化蛹中的双重功能,DA通过DopEcR促进幼虫的进食和生长,20E与DA竞争结合DopEcR,并通过DopEcR作为细胞膜受体之一来传递20E信号,从而促进昆虫变态,揭示了类固醇激素与多巴胺系统的互作,阐明了 20E抑制鳞翅目昆虫取食并促进变态发育的分子机制,为类固醇激素信号途径及其与神经系统互作提供了新的理论,为害虫控制提供了新的生长调节剂的研制靶点。2.证明了 ErGPCR-2可以结合20E,支持了前面的研究结论—ErGPCR-2是20E的细胞膜受体。3.证明了 GPCR-3是20E的细胞膜受体,20E结合并诱导GPCR-3形成同源四聚体传导20E信号,并作为转运蛋白易化20E扩散进入细胞。首次发现GPCR可以通过形成同源四聚体促进20E的细胞导入。