【摘 要】
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猪繁殖与呼吸综合征(Porcinereproductiveandrespiratorysyndrome,PRRS)是由PRRS病毒引起的猪繁殖障碍和呼吸障碍,临床上主要以妊娠母猪繁殖障碍出现流产,仔猪出现呼吸道症状,并且感染后死亡率较高,又称蓝耳病。猪繁殖与呼吸综合征最早在美国被发现,随后迅速传播至世界各地,此病目前被OIE认定为法定报告疫病,属于二类动物疫病。20
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猪繁殖与呼吸综合征(Porcinereproductiveandrespiratorysyndrome,PRRS)是由PRRS病毒引起的猪繁殖障碍和呼吸障碍,临床上主要以妊娠母猪繁殖障碍出现流产,仔猪出现呼吸道症状,并且感染后死亡率较高,又称蓝耳病。猪繁殖与呼吸综合征最早在美国被发现,随后迅速传播至世界各地,此病目前被OIE认定为法定报告疫病,属于二类动物疫病。2006年此病在我国也迅速传播,并且出现毒株变异现象。GP5蛋白是由PRRS病毒的开放阅读框ORF5编码的囊膜蛋白,具有较高的变异性。目前有研究表明GP5蛋白有两个抗原表位分别是:非中和性A抗原表位和中和性B抗原表位。PRRSV感染机体后最先产生非中和性抗体(7d左右)但不具备中和病毒的能力,在感染后28d左右产生中和性抗体但抗体的滴度相对较低并不能清除病毒,这也是PRRSV逃逸机体免疫监视的主要机制,也是感染的主要特征。目前有研究发现在中和性表位B上及其周围有多个糖基化位点,研究推测有可能糖基化位点的存在对B抗原表位产生覆盖,这使得中和抗体的产生受到阻碍出现延迟以及抗体效价的降低。目前有报道的糖基化位点有:第30、34、35、44、51位氨基酸,本实验室已经对这五个糖基化位点进行了定点突变,并成功构建真核质粒pVAX1-N30A、pVAX1-N34A、pVAX1-N35A、pVAX1-N44A、pVAX1-N51A;并且对这些质粒转染293T细胞收蛋白进行WesternBlot分析,结果显示第35位和51位突变体的蛋白含量高于原GP5蛋白,同时动物试验结果显示第35位突变体的中和抗体也出现显著提高。鉴于杆状病毒表达系统高表达水平和糖基化修饰较哺乳动物简单等特点,本研究将第35、51位突变体以及原序列质粒通过酶切、连接、转化以及转座等试验过程构建重组Bacmid穿梭质粒。将构建的重组穿梭质粒转染Sf9细胞进行增殖,收取重组杆状病毒感染Sf9细胞,通过SDS-PAGE、WesternBlot结果可以看到目的蛋白条带印迹;通过IFA试验可见感染三组重组杆状病毒的Sf9细胞均可检测到特异性荧光(绿色),而野生型Bacmid感染的Sf9细胞和正常的Sf9细胞并没有检测特异性荧光,由此可见重组杆状并病毒携带的目的基因在Sf9细胞内成功表达并产生GP5蛋白,且于GP5鼠源单克隆抗体发生特异性结合。以上结果表明第35位、51位糖基化突变位点的重组杆状病毒构建成功,并且可在Sf9细胞中进行翻译表达。获得的重组杆状病毒命名为:AcMNPV-ORF5、AcMNPV-N35A、AcMNPV-N51A。将上述试验中构建的重组杆状病毒免疫兔子(结合杆状病毒的特点不会对哺乳动物致病),定期采集血清,测定中和抗体的效价情况。中和抗体结果显示在第14d时,ACMNPV-N35A组所测得中和抗体滴度明显高于AcMNPV-ORF5组,有显著性差异(p
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