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本论文主要包括以下两部分研究内容:1.前期研究中,我们采用小鼠卵母细胞胞浆内精子注射(ICSI)技术,成功地用新鲜精子获得了生理健康的ICSI小鼠。在此基础上,本文结合细胞冻干技术,进行了冻干精子ICSI生产试管小鼠的尝试。B6D2F1成年公鼠的精子在Tris-HCl-EDTA(pH8.2)溶液中冻干4h后解冻,将其精子头注入到KM小鼠成熟卵母细胞的胞质中。6h后,83.0%的卵子受精。用CZB溶液体外培养发现,冻干精子生产的胚胎,体外发育至2-C(92.0%vs99.2%)、4-C(52.7%vs96.6%)、桑椹胚(36.6%vs90.8%)和囊胚的比例(21.4%vs68.1%)极显著地(p<0.01)低于新鲜精子生产的ICSI胚胎。移植2-C期冻干精子ICSI胚胎检测体内发育,结果发现,D10的着床率为63.0%(17/27);胎鼠的出生比例为21.7%(13/60),这些ICSI小鼠成年后的生理和生殖能力正常。试验中首次发现,冻干时间影响ICSI胚胎的发育,冻干4h和冻干8h的精子生产的ICSI胚胎囊胚率分别是20.9%和10.0%。试验结果说明,精子冻干后,仍能生产ICSI动物,冻干技术可以用于哺乳动物精子的保存。
2.本研究首先将常规的小鼠体细胞核移植的方法进行了部分的改动,在此基础上使卵母细胞操作后的活率有了极大的提高。之后比较了两种品系小鼠核移植后的胚胎体外发育。结果发现B6D2F1和KM小鼠的克隆胚胎形成原核的比例(91.2%vs93.5%)和卵裂(91.2%vs90.4%)的比例没有显著的差异(p>0.05),与孤雌激活组比较也没有显著的差异(p>0.05)。B6D2F1小鼠克隆胚胎体外发育至4-C(54.9%vs31.3%)、桑椹胚(36.3%vs16.5%)和囊胚的比例(27.5%vs9.6%)极显著地(p<0.01)高于KM小鼠克隆胚胎相应阶段的发育率,两种品系小鼠的克隆胚胎在4-C、桑椹胚和囊胚期都极显著(p<0.01)地低于孤雌激活组。初步结果证明杂交品系小鼠的核移植胚胎比KM小鼠的核移植胚胎有更高的体外发育比例。